SPATA12基因在氧化損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、正常生理情況下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平會(huì)維持在一定的范圍內(nèi)，并發(fā)揮其重要的生理功能。外源或病理因素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的氧化還原狀態(tài)失衡，進(jìn)而引起ROS的積累。ROS具有強(qiáng)氧化性，會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)（包括酶）、糖脂類等重要生物大分子進(jìn)行攻擊，阻礙其正常生理功能的發(fā)揮，引起細(xì)胞的氧化損傷。ROS引起的細(xì)胞損傷與人類大部分的疾病相關(guān)，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥和肺的纖維化等。因此

2、，進(jìn)行有關(guān)抗氧化的研究對(duì)了解或診治這些疾病具有重要的意義。
　　SPATA12(Spermatogenesis Associated Gene12，SPATA12)是一個(gè)精子發(fā)生相關(guān)基因。在前期的工作中，本課題組發(fā)現(xiàn)SPATA12在紫外誘導(dǎo)的DNA損傷過(guò)程中發(fā)揮作用，這提示我們其可能也參與了氧化應(yīng)激損傷修復(fù)過(guò)程?；诖耍疚膹囊韵氯齻€(gè)方面探討了SPA TA12在抗氧化損傷中的作用。
　　1.細(xì)胞氧化損傷模型的建立
　　

3、ROS主要包括超氧陰離子(O2-·)、羥自由基(OH·)和過(guò)氧化氫(H2O2)等，是引起細(xì)胞氧化損傷的重要因素。在本研究中，采用H2O2為氧化劑，以HeLa或MCF-7為實(shí)驗(yàn)材料，建立細(xì)胞氧化損傷模型。用0～70μM的H2O2處理細(xì)胞8h，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT分析、生化檢測(cè)等方法發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的升高，細(xì)胞的形態(tài)逐漸改變，存活率降低，細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力降低，谷胱甘肽(GSH)的含量減少;而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(MDA)的

4、含量上升，說(shuō)明H2O2對(duì)細(xì)胞造成了氧化損傷。
　　2.SPATA12的抗氧化損傷功能及其作用機(jī)制
　　基于上述細(xì)胞氧化損傷模型，采用定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在H2O2的作用下，SPA TA12的表達(dá)明顯上調(diào)，表明SPA TA12能夠響應(yīng)氧化應(yīng)激信號(hào)的誘導(dǎo)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AP-1參與了SPA TA12應(yīng)答H2O2刺激的生理過(guò)程，其位于SPATA12啟動(dòng)子區(qū)域的TRE元件發(fā)揮了重要作用。而HSF1 de

5、coyODNs實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子HSF1在SPA TA12響應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用不明顯。
　　隨后，通過(guò)PI染色實(shí)驗(yàn)的分析表明，SPATA12能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;通過(guò)對(duì)氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SPATA12能夠降低細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS的含量。這些結(jié)果表明，SPATA12可能具有抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的功能。
　　3.抗氧化中藥單體對(duì)SPA TA12表達(dá)的影響
　　通過(guò)MTT、定量PCR等方法，

6、我們還檢測(cè)了白藜蘆醇、熊果酸、槲皮素和淫羊藿苷等四種具有抗氧化作用的中藥單體對(duì)SPATA12表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，20μM濃度的白藜蘆醇能夠上調(diào)SPATA12 mRNA的表達(dá)，而其他中藥單體不能明顯提高SPATA12的表達(dá)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AP-1的TRE元件在SPATA12應(yīng)答白藜蘆醇的過(guò)程中同樣也發(fā)揮了重要作用。
　　綜上，本研究證實(shí)了SPATA12能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子AP-1來(lái)應(yīng)答外源ROS的刺激;