小麥類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白TaCBL4和TaCBL3的功能研究.pdf

1、非生物逆境是作物產(chǎn)量的主要制約因素?，F(xiàn)代分子生物學(xué)手段現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于育種研究，并獲得不少具有優(yōu)良耐逆能力的作物新品種。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like proteins，CBL)是一類重要的鈣信號受體蛋白，在非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用，主要通過與CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases，CIPK)相互作用將信號向下游傳遞。擬南芥中CBL和CIPK家族成員在耐

2、逆中的作用已有較深入的研究，其中AtSOS3(CBL4)和AtCIPK24(SOS2)是SOS途徑的兩個關(guān)鍵組分，在植物鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。但是小麥中CBL和CIPK家族成員功能以及是否存在SOS途徑還不清楚，SOS途徑在植物中是否具有保守性和通用性還未見報道。
　　 本研究基于以上科學(xué)問題，利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析了小麥CBL和CIPK基因家族，從本室培育的小麥漸滲系耐鹽品種山融3號(SR3)中克隆了一系列TaCBLs

3、和TaCIPKs基因，并初步驗證了TaCBL4、TaCBL3在非生物脅迫應(yīng)答中的功能。
　　 一、小麥CBL和CIPK的生物信息學(xué)分析和新基因克隆
　　 通過生物信息學(xué)分析，電子克隆了14個小麥CBL家族成員和34個小麥CIPK家族成員。多序列比對及進化樹分析顯示，這些TaCBLs在大小和結(jié)構(gòu)上非常保守，其中5個具有豆蔻?；稽c，2個具有跨膜疏水區(qū)，暗示這7個TaCBLs在抗逆中發(fā)揮重要作用。TaCIPKs間序列差異比較

4、大，但結(jié)構(gòu)十分保守。SR3中TaCIPKs間也存在差異，這可能與基因倍增過程相關(guān)。進化樹分析顯示，小麥中TaCBLs和TaCIPKs都存在許多旁系同源基因，并且它們與水稻中同源基因的相似性高于擬南芥。
　　 將這些電子克隆的TaCIPK基因與實驗室定制的小麥cDNA芯片探針進行比對，以分析它們的鹽脅迫應(yīng)答特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個TaCIPKs在芯片中有特異性匹配探針，其中4個為鹽誘導(dǎo)表達基因，4個鹽下調(diào)表達基因;另外，芯片中有3個探

5、針分別對應(yīng)多個TaCIPK序列，而且這3個探針在鹽脅迫24 h后表達量都顯著提高。這些鹽脅迫應(yīng)答的TaCIPKs可能都參與植物的鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)，其功能需要進一步研究。
　　 根據(jù)電子克隆序列，從SR3中克隆3個TaCBL和9個TaCIPK新基因，按照與擬南芥 CBLs的同源性，分別命名為 TaCBL1/3/4和TaCIPK2/8/11/15/17/19/30/32/34。TaCIPKs中，TaCIPK8、TaCIPK15在鹽脅迫

6、下上調(diào)表達，TaCIPK11下調(diào)表達，其他基因的應(yīng)答模式有待進一步驗證，為耐鹽候選基因的鑒定及TaCBL互作蛋白的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、小麥TaCBL4和TaCBL3功能分析
　　 1、 TaCBL4結(jié)構(gòu)與可能作用分析
　　 TaCBL4有7個內(nèi)含子，其編碼產(chǎn)物定位于細胞膜，與擬南芥同源基因AtSOS3（CBL4）相似，是AtSOS3同源基因。TaCBL4在小麥的根、葉、莖、幼穗、麥芒、幼胚、旗葉等組織中均

7、能表達，NaCl脅迫下其表達量明顯增加，表明TaCBL4在小麥生長發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答過程中均發(fā)揮重要作用。
　　 為了驗證TaCBL4的生物學(xué)功能及其與AtSOS3的異同，將其在擬南芥Col-0野生型和sos3突變體中異源表達，觀察表型變化，并用AtSOS3在擬南芥中的過表達系作為對照。TaCBL4過表達不影響擬南芥的營養(yǎng)和生殖生長。在1/2 MS培養(yǎng)基中，Col-0(WT)、TaCBL4過表達野生型系(OE)、TaCBL4過表達

8、sos3(sOE)幼苗根長和地上部分無顯著性差異。NaCl脅迫下，與WT相比，sos3幼苗的主根更短、地上部分漂白程度高，與朱建康實驗室結(jié)果一致;而OE系和sOE系幼苗根與WT沒有顯著差別，但是葉片顯著變小。這顯示，TaCBL4能夠恢復(fù)sos3根的表型，但首次發(fā)現(xiàn)OE系和sOE系在脅迫下抑制葉生長。LiCl脅迫下，與WT相比，sos3幼苗的主根明顯變短、地上部分變小，而OE系、sOE系及AtSOS3過表達系幼苗正好相反，主根更長、地上部

9、分更大，首次表明TaCBL4和AtSOS3過表達可以提高幼苗期鋰離子脅迫抗性。在ABA處理和滲透脅迫下，不同株系無明顯差異，表明TaCBL4是一個離子特異性響應(yīng)基因。
　　 相比植株發(fā)育，鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響更大。為了分析TaCBL4在這一階段是否發(fā)揮重要作用，我們以綠色子葉張開率為標(biāo)準(zhǔn)，比較了不同株系在鈉、鋰離子脅迫下的萌發(fā)率差異。NaCl脅迫下，sos3不萌發(fā)，WT萌發(fā)率降低，而OE系和sOE萌發(fā)率受影響少，萌發(fā)率明顯比W

10、T高。LiCl處理下，WT和sos3的萌發(fā)率降低，其中sos3降低更明顯，而OE系和sOE萌發(fā)率無顯著變化。
　　 高鹽土壤一般堿性較高，我們發(fā)現(xiàn)與WT相比，OE系在鹽堿條件下的萌發(fā)率明顯提高。
　　 以上結(jié)果顯示，TaCBL4和AtSOS3一樣，也是鈉、鋰離子特異性響應(yīng)基因，并且TaCBL4和AtSOS3在鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮相似的功能，表明小麥中也存在SOS系統(tǒng)，而且不同植物間SOS系統(tǒng)存在保守性和通用性。本實驗發(fā)現(xiàn)，T

11、aCBL4在小麥抗鈉離子育種中應(yīng)該有針對性地設(shè)計在種子萌發(fā)階段特異性表達，而在抗鋰離子育種中則不受此限制。
　　 有趣的是，低鉀條件下，與Col-0相比，OE系和sOE系幼苗的地上部分明顯變小，而AtSOS3過表達系則無顯著變化，推測TaCBL4可能還調(diào)控鉀離子通道的活性。這一結(jié)果表明，TaCBL4在鹽脅迫應(yīng)答中的作用與鉀相關(guān)，幼苗階段TaCBL4降低對Na+的耐性是由于負(fù)調(diào)控K+的轉(zhuǎn)運引起的，顯示了不同物種間SOS系統(tǒng)的特異性

12、。
　　 為了進一步認(rèn)識TaCBL4的作用機制及其與AtSOS3功能的異同，我們利用酵母雙雜交方法分離擬南芥中與TaCBL4相互作用的CIPK蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaCBL4能與AtCIPK5/10/11/15/18/21/24這7個CIPKs互作，其中AtCIPK15/24為AtSOS3互作蛋白，而AtCIPK6/7不與TaCBL4互作。推測TaCBL4通過與AtCIPK11相互作用而抑制了后者活性，提高了植株的抗鹽堿性，通過At

13、CIPK24(SOS2)互作而激活SOS通路促進Na+外排。TaCBL4和AtSOS3互作CIPKs種類存在相似性和特異性，而且TaCBL4和AtSOS3對與其共同互作的CIPKs的調(diào)控也可能存在差異性，那么這種特異性和差異性是否與TaCBL4過表達導(dǎo)致的低鉀敏感型相關(guān)，需要進一步研究。
　　 2、 TaCBL3功能的初步分析
　　 TaCBL3與水稻OsCBL6及擬南芥AtCBL2、AtCBL6相似性較高，其編碼蛋白定

14、位于液泡膜。離子和滲透脅迫下，TaCBL3過表達擬南芥株系與Col-0無明顯差異。缺鉀誘導(dǎo)TaCBL3的表達，而且缺鉀條件下，與Col-0相比，TaCBL3過表達株系黃化更嚴(yán)重，植株生長抑制程度更顯著。這表明，TaCB(L)3可能是鉀離子通道的抑制因子，為植物離子轉(zhuǎn)運機制研究提供了新的基因資源。
　　 總之，本論文通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)分析了小麥CBL和CIPK家族成員的序列和表達特征，通過CBL4的功能分析明確了