陰溝腸桿菌海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)鑒定及體外分子改良.pdf

1、海藻糖普遍存在于自然界，是一種非還原性二糖。海藻糖酶可以將海藻糖特異性地水解為葡萄糖，海藻糖酶作為食品添加劑可以治療二糖缺乏癥，人體內(nèi)某些腎臟疾病的診斷可以通過(guò)檢測(cè)尿海藻糖酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)，故而海藻糖酶在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值，此外，也可以通過(guò)研究海藻糖酶的結(jié)構(gòu)與功能開發(fā)新型酶抑制劑應(yīng)用于昆蟲防治中。
　　本研究從陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae strain AR_0002)中克隆到了一個(gè)海藻糖酶基

2、因，將其命名為treE。treE基因全長(zhǎng)1650bp，GC含量58％，編碼549個(gè)氨基酸，分子量為63.5kDa，預(yù)測(cè)的pI為4.93。與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的海藻糖酶基因序列對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，treE與來(lái)自于Enterobacter Cloacae ATCC13047的海藻糖酶基因序列具有88％的一致性。
　　酶學(xué)性質(zhì)分析表明，treE的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和6.0。在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，酶在4℃條件下處理了48h，保持

3、了80％以上的活性，說(shuō)明在偏中性的條件下，該酶的穩(wěn)定性良好。Mn2+，F(xiàn)e3+(1mM，5mM)，Co2+(1mM)可以提高treE的活性， Cu2+，F(xiàn)e3+(10mM)，Mg2+(10mM)，Co2+(10mM)抑制了treE的活性。最適條件下，treE的Km是3.318 mmol/L，Vmax是0.445 mmol/L·min， kcat是1265.164s-1，催化效率(kcat/Km)為381.303 L·mmol-1·s-1

4、。
　　為了提高treE的催化活性，對(duì)treE進(jìn)行了體外誘變，構(gòu)建了隨機(jī)突變文庫(kù)，利用實(shí)驗(yàn)室建立的高通量篩選方法，我們從16000個(gè)隨機(jī)突變體中篩選獲得了一個(gè)酶活提高突變子1-D8。序列分析表明，1-D8含有兩個(gè)突變位點(diǎn):Tyr22Cys和Trp491Arg。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，1-D8的最適反應(yīng)溫度為45℃，比野生型降低了5℃;最適反應(yīng)pH為6.5，用pH5.5-9.0的緩沖液在4℃下處理48h后，仍保留80％以上的活性。動(dòng)力學(xué)分

5、析表明，1-D8的Km是3.082 mmol/L，kcat值為1819.651 s-1，kcat/Km值為590.412 L·mmol-1·s-1，比野生型提高了54.8％。
　　為了探究1-D8中兩個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)酶活的影響，本研究依次對(duì)它們進(jìn)行了單點(diǎn)回復(fù)突變。酶動(dòng)力學(xué)分析表明， Y22C的Km是3.355mmol/L， kcat為1331.910 s-1，催化效率(kcat/Km)為396.993 L·mmol-1·s-1，比野生

6、型提高了4.0％。突變體W491R的Km值為3.060mmol/L，kcat值為1734.137s-1，催化效率(kcat/Km)為566.711 L·mmol-1·s-1，比野生型高了48.6％。這表明1-D8活性的提高主要來(lái)自突變位點(diǎn)W491R的貢獻(xiàn)。
　　此外，本研究通過(guò)結(jié)構(gòu)模擬與分子對(duì)接，初步確定R168可能與treE的催化效率有關(guān)。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們構(gòu)建了單點(diǎn)突變R168G，其Km為2.380mmol/L，kcat為