海藻糖合酶生產(chǎn)菌株優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、海藻糖是一種無還原性雙糖，分子式是C12H22O11?2H2O，廣泛分布于自然界中許多生物細(xì)胞中。海藻糖是一種生物應(yīng)激代謝產(chǎn)物，在一些極端環(huán)境生長的古生菌、真菌，以及生長在不良環(huán)境中的動(dòng)植物細(xì)胞中海藻糖含量較高。海藻糖在生物細(xì)胞中的作用是保護(hù)細(xì)胞抵抗不良環(huán)境的影響，并且可以作為細(xì)胞供能物質(zhì)，其功能是保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子空間結(jié)構(gòu)和功能活性，維持細(xì)胞滲透壓和防止細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分流失。由于海藻糖具有以上功能，可用于醫(yī)學(xué)生物制品

2、中起到保護(hù)劑的作用；同時(shí)海藻糖也可以用于增強(qiáng)農(nóng)作物抗逆性，通過轉(zhuǎn)基因手段來培育耐鹽堿型農(nóng)作物，培育抗凍果蔬等；同時(shí)，海藻糖不具有還原性，不會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，可以作為穩(wěn)定的添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)。因此，對(duì)海藻糖進(jìn)行研究具有重要意義。
　　工業(yè)上普遍采用酶法來生產(chǎn)海藻糖，該方法生產(chǎn)效率較高，并且無污染，節(jié)約能源，省時(shí)省力。酶法生產(chǎn)海藻糖的關(guān)鍵在于獲得活性較高的海藻糖合成酶，目前在微生物細(xì)胞中總共發(fā)現(xiàn)了7種海藻糖合成酶共5條合成途徑，分別

3、是海藻糖合酶途徑（TreS途徑）、TreYZ途徑、OtsAB途徑、TreT途徑和TreP途徑。從目前研究方向來看，主要集中于尋找含有海藻糖合成途徑的菌株并進(jìn)行改良獲得海藻糖高產(chǎn)菌株，從中直接提取海藻糖或者海藻糖合酶，改良手段主要包括傳統(tǒng)誘變、以及基因工程改良，兩種方法都可以獲得高產(chǎn)突變株。
　　本研究以細(xì)胞內(nèi)含有3條海藻糖合成途徑（TreS途徑、TreYZ途徑、OtsAB途徑）共5種酶（TreS,MTSase,MTHase,TPS

4、,TPP）的谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）作為出發(fā)菌株，采用傳統(tǒng)紫外-化學(xué)藥物誘變方法獲得海藻糖高產(chǎn)突變株，然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)海藻糖合成酶的提取并對(duì)酶性質(zhì)進(jìn)行分析，再進(jìn)行培養(yǎng)基以及發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化獲得最佳培養(yǎng)條件。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)改良以后的突變株在最佳優(yōu)化培養(yǎng)條件下的海藻糖合酶產(chǎn)出為621U/mL，較優(yōu)化之前提高了1.88倍，并且突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　?。?）經(jīng)過傳統(tǒng)誘變處理后所獲得突變株，

5、其海藻糖生產(chǎn)能力得到大幅度提高，達(dá)到1.28g/100g干重·h-1，出發(fā)野生型菌株生產(chǎn)能力為0.45g/100g干重·h-1。經(jīng)過傳代試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）通過對(duì)酶性質(zhì)進(jìn)行分析可以有效的利用合成酶來生產(chǎn)海藻糖，海藻糖合酶具有可逆的酶活性，對(duì)其催化反應(yīng)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件，在最佳催化反應(yīng)條件下，海藻糖合酶由麥芽糖向海藻糖的轉(zhuǎn)化率為81.1％。海藻糖合酶、MTSas

6、e、MTHase、TPS和TPP酶最適反應(yīng)pH值分別為：7.0,7.5,6.5,6.5,7.5，酶最適pH范圍分別為：pH6.5-8.0,pH6.5-7.5,pH6.0-7.5,pH6.0-7.5,pH6.5-8.0。酶最適反應(yīng)溫度分別為35℃,35℃,40℃,35℃,35℃，酶最適溫度范圍為：30-35℃,35-40℃,30-45℃,25-40℃,30-35℃。
　　（3）使用析因設(shè)計(jì)（FFD）—中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)對(duì)培養(yǎng)基組

7、分進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最大海藻糖合酶產(chǎn)出，首先通過析因設(shè)計(jì)得到對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的因素，然后進(jìn)行CCD設(shè)計(jì)找到最佳培養(yǎng)基組分方案。得到最佳培養(yǎng)基組分為：麥芽糖22.00g/L，牛肉膏7.49g/L，NaCl13.36g/L，K2HPO411.33g/L，蛋白胨15.00g/L。通過單因素試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件為pH7.0，接種量為108個(gè)/mL，發(fā)酵溫度34℃，在培養(yǎng)種齡30h后提取海藻糖合酶，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，選擇裝液量70mL/2