陰溝腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、近年來發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌能引起包括呼吸道感染、泌尿生殖道感染、皮膚軟組織感染以及血流感染在內(nèi)的各種感染，已成為醫(yī)院感染重要的病原菌。比較上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測資料，顯示本院的腸桿菌屬細(xì)菌對(duì)包括β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類等臨床常用的3類抗菌藥物的耐藥性問題更為突出。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)上述臨床常用的3種抗菌藥物的耐藥機(jī)制研究顯示：1.產(chǎn)生ESBLs及AmpC酶是該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機(jī)制，而編碼產(chǎn)ESBLs及Amp

2、C酶的基因大多由質(zhì)粒介導(dǎo)；2.對(duì)氨基糖苷類耐藥主要因產(chǎn)aaC(3)-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，aac(6’)一Ⅰ、Ⅱ等基因介導(dǎo)的氨基糖苷類鈍化酶以及產(chǎn)由rmtB、armA等基因介導(dǎo)的氨基糖苷類甲基化酶所致，以上基因亦通常位于質(zhì)粒上；3.近年發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒qnr：基因可介導(dǎo)喹諾酮類耐藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道①大多數(shù)失活酶和鈍化酶的編碼基因均由質(zhì)粒介導(dǎo)。質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的酶大多為結(jié)構(gòu)型、固有的，不需要誘導(dǎo)劑即可大量產(chǎn)生，這些酶對(duì)β一內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等相應(yīng)抗菌藥物行水解

3、或修飾鈍化作用，造成細(xì)菌對(duì)抗菌藥物高水平耐藥；②同一耐藥質(zhì)粒上常同時(shí)攜帶β一內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類以及磺胺藥、季胺類消毒劑等多種耐藥基因，故可引起細(xì)菌對(duì)多種抗菌藥物同時(shí)耐藥；③質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可隨著質(zhì)粒在腸桿菌科細(xì)菌的種和屬之間廣泛傳播，故質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性在臨床上具有十分重要的意義。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)臨床分離陰溝腸桿菌的PFGE譜顯示無明顯的流行克隆但其耐藥譜竟如此相同，提示這些菌株中可能攜帶有相同或相似的耐藥質(zhì)粒。因此有必

4、要對(duì)陰溝腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　本課題對(duì)本院2005年臨床分離的101株陰溝腸桿菌進(jìn)行了研究，研究了這些菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性、同源性，檢測了以上菌株對(duì)臨床上常用的3類抗菌藥物質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，并對(duì)臨床菌株進(jìn)行了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)，檢測了質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因和基因的結(jié)構(gòu)。
　　第一部分:陰溝腸桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)及同源性分析
　　采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測定了頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、阿米

5、卡星等13種抗菌藥物對(duì)101株臨床分離的陰溝腸桿菌的最低抑菌濃度。結(jié)果顯示本組101株陰溝腸桿菌對(duì)頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥率分別為53.4％和51.4％，但對(duì)頭孢吡肟較為敏感，細(xì)菌耐藥率為10.9％。本組資料同時(shí)顯示該菌對(duì)酶抑制劑復(fù)方制劑頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦十分敏感，細(xì)菌耐藥率均為16.9％。碳青霉稀類抗生素的抗菌活性最強(qiáng)，細(xì)菌敏感率為100％。該菌對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為35.6％和31.7％；對(duì)阿米卡星的

6、耐藥率較低為19.8％，但對(duì)慶大霉素耐藥率為41.6％。本組細(xì)菌耐藥譜顯示101株陰溝腸桿菌中對(duì)第三代頭孢菌素耐藥同時(shí)對(duì)喹諾酮類或氨基糖苷類耐藥的菌株為30株(29.7％，30/101)，對(duì)第三代頭孢菌素、喹諾酮類和氨基糖苷均耐藥的菌株為22株(21.8％，22/101)。
　　101株陰溝腸桿菌的PFGE分型結(jié)果顯示本組細(xì)菌同源菌株很少，僅有3組共7株細(xì)菌分別屬同一克隆株，余94株細(xì)菌PFGE圖譜均不相同，提示在本院范圍內(nèi)無陰溝

7、腸桿菌同一克隆株的流行，但以上不同克隆株經(jīng)常表現(xiàn)出相同或相似的耐藥譜型，提示這些不同的菌株內(nèi)可能攜帶相同或相似的耐藥質(zhì)粒。
　　第二部分:陰溝腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的分子生物學(xué)研究
　　本部分研究采用酚/氯仿法對(duì)101株臨床分離陰溝腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒DNA抽提后，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs和AmpC酶基因，氨基糖苷類鈍化酶和氨基糖苷類甲基化酶基因，以及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥的三種主要基因。
　　1.質(zhì)粒介導(dǎo)的E

8、SBLs和AmpC酶基因檢測采用酚/氯仿法制備陰溝腸桿菌質(zhì)粒DNA模板，運(yùn)用TEM型、SHY型、CTX-M型引物以及質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的6對(duì)引物MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX等對(duì)101株陰溝腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序結(jié)果顯示72株(71.3％，72/101)含有質(zhì)粒介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶，其中37株(36.6％，37/101)菌株含有TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因，54株(53.5％，54/101)攜帶SHV-12型ESBLs，

9、31株(30.7％，31/101)含CTX-M型ESBLs基因。18株(17.8％，18/101)含DHA-1型AmpC酶。上述72株菌株中僅含TEM-1型基因或僅含DHA-1型AmpC酶基因各1株，余70株(69.3％，70/101)均為產(chǎn)ESBLs菌株，其中46株(45.5％，46/101)含兩種或兩種以上β-內(nèi)酰胺酶基因。
　　2.質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因檢測本研究以細(xì)菌質(zhì)粒DNA為模板，運(yùn)用qnrA、qnrB、qnrS、q

10、nrC、qnrD、aac(6’)-Ib及qepA基因引物，對(duì)101株陰溝腸桿菌采用PCR方法進(jìn)行了擴(kuò)增，并對(duì)qnr基因進(jìn)行了測序分型；同時(shí)檢測了染色體介導(dǎo)的DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的gyrA和parC基因突變和相應(yīng)氨基酸突變。結(jié)果顯示101株陰溝腸桿菌中共有39株細(xì)菌為qnr基因陽性(38.6％，39/101)，其中19株(18.8％，19/101)細(xì)菌為qnrA基因陽性；18株(17.8％，18/101)細(xì)菌為qnrB基因陽性；3

11、株(3.0％，3/101)細(xì)菌為qnrS基因陽性。其中1株細(xì)菌同時(shí)攜帶qnrB及qnrS兩種基因。101株陰溝腸桿菌中未檢測出qnrC及qnrD基因。所有qnr基因陽性菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)測序并與GenBank上基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示19株qnrA基因陽性菌株均為qnrA1亞型，18株qnrB基因陽性菌株中有16株為qnrB4亞型，1株為qnrB6亞型，1株為qnrB10亞型；3株qnrS基因陽性菌株中1株為qnrS1亞型，1株為qn

12、rS2亞型，另有1株菌株同時(shí)含有qnrB4和qnrS1兩種qnr基因。101株陰溝腸桿菌中有44株細(xì)菌采用PCR方法擴(kuò)增到aac(6’)-Ib基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。該44株細(xì)菌的aac(6’)-Ib基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)FokI酶切后其中7株細(xì)菌因缺乏GGATG位點(diǎn)，無法切開，此7株(6.9％，7/101)同時(shí)經(jīng)序列測定確證為aaac(6’)-Ib乃基因突變株-aac(6’)-Ib-cr菌株，其中4株同時(shí)攜帶qnrB4基因，余37株FokI酶切均可

13、切開，為aac(6’)-Ib野生型菌株。101株陰溝腸桿菌中未擴(kuò)增到qepA基因。
　　對(duì)39株qnr基因陽性的菌株采用PCR方法擴(kuò)增了gyrA和parC基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)域(QRDR)，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序。與Genbank進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示有23株qnr基因檢測陽性的菌株GyrA和ParCQRDR區(qū)域氨基酸無突變，該類菌株均為環(huán)丙沙星敏感株(按CLSI2006年標(biāo)準(zhǔn))。一株細(xì)菌的GyrAQRDR區(qū)域83位Ser突變

14、為Tyr，該菌株為環(huán)丙沙星中敏株。另外在15株qnr基因檢測陽性發(fā)現(xiàn)QRDR區(qū)域發(fā)生1-3個(gè)位點(diǎn)突變，包括GyrAQRDR區(qū)域83位Ser(絲氨酸)突變?yōu)镮1e(異亮氨酸)或Phe(苯丙氨酸)或Leu(亮氨酸)及87位Asp(天冬氨酸)突變?yōu)锳1a(丙氨酸)，ParCQRDR區(qū)域80位Ser(絲氨酸)突變?yōu)镮1e(異亮氨酸)，該類菌株均為環(huán)丙沙星耐藥株。
　　101株陰溝腸桿菌中有36株環(huán)丙沙星耐藥株，其中含qnr基因陽性的菌株為

15、15株，陽性檢出率為41.7％(15/36)；在63株環(huán)丙沙星敏感菌株中qnr基因陽性菌株23株，陽性率為36.5％(23/63)。兩組細(xì)菌qnr基因陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23)，提示在喹諾酮耐藥或不耐藥的兩組菌株中qnr基因檢出率相仿。本研究39株qnr陽性菌株中有23株細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星敏感，這些菌株的GyrA和ParCQRDR區(qū)域無氨基酸突變，其環(huán)丙沙星的MIC值為0.06mg/L-1mg/L。與野生株相比(通常

16、野生株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC≤0.015mg/L)，MIC值明顯降低。提示這些細(xì)菌對(duì)喹諾酮類敏感性的下降可能僅由qnr所致，推測qnr也可能是細(xì)菌在對(duì)喹諾酮類耐藥性形成過程中最早出現(xiàn)的耐藥機(jī)制。
　　101中株陰溝腸桿菌中70株細(xì)菌含有ESBLs酶基因，其中35株(50％，35/70)qnr基因陽性，而31株非產(chǎn)ESBLs菌株中僅4株(12.9％，4/31)細(xì)菌為qnr基因陽性，兩組細(xì)菌的qnr基因檢測陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P=0.005)。在18株質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶陽性菌株中14株(77.8％，14/18)細(xì)菌出現(xiàn)qnr基因陽性，而83株非產(chǎn)AmpC酶菌株中有25株(30.1％，25/83)細(xì)菌qnr基因陽性，兩組細(xì)菌的qnr基因檢測陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，上述結(jié)果提示產(chǎn)ESBLs或者質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的菌株較非產(chǎn)酶株更易同時(shí)攜帶qnr基因。
　　3.質(zhì)粒介導(dǎo)氨基糖苷類鈍化酶和氨基糖苷類甲基化酶檢測。本研究應(yīng)用aa

18、c(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(6’)-Ib、aac(6’)-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅵ等8種氨基糖苷類鈍化酶基因和armA及rmtB2種氨基糖苷類甲基化酶基因引物對(duì)101株陰溝腸桿菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示48株(47.5％，48/101)被檢測出含有氨基糖苷類鈍化酶基因；13株(12.9％，13/101)細(xì)菌含有armA或rmtB甲基化酶基因，其中10株(9.9％，10

19、/101)同時(shí)檢測出含氨基糖苷類鈍化酶和氨基糖苷類甲基化酶基因。
　　48株氨基糖苷類鈍化酶基因陽性的菌株中有44株(43.5％，44/101)菌株被檢測出含有aac(6’)-Ib基因，其中有7株為aac(6’)-Ib-Cr(aac(6’)-Ib基因突變株)；22株(21.8％，22/101)含ant(2”)-Ⅰ基因；6株(5.9％，6/101)含aac(3)-Ⅱ基因；1株(1.0％，1/101)含aac(3)-Ⅰ基因；2株(2.

20、0％，2/101)含ant(3”)-Ⅰ基因。而aac(3)-Ⅲ、aac(6’)-Ⅱ和aph(3’)-Ⅵ等3種氨基糖苷類鈍化酶基因在本組101株陰溝腸桿菌中均未檢出。
　　在13株(12.9％，13/101)被檢測為含有armA或rmtB氨基糖苷類甲基化酶基因的菌株中含armA基因?yàn)?2株(11.9％，12/101)，含rmtB基因?yàn)?株(2.0％，2/101)。其中1株同時(shí)含有armA和rmtB基因。13株含氨基糖苷類甲基化酶菌株

21、均表現(xiàn)為對(duì)阿米卡星和慶大霉素高度耐藥，上述兩種抗生素的MIC值均>256mg/L。在含氨基糖苷類鈍化酶基因的菌株中呈現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類不同的耐藥水平。如含單-aac(6’)-Ib基因的菌株中表現(xiàn)為慶大霉素MIC值從4mg/L到>256mg/L不等。
　　在101株陰溝腸桿菌中共有70株(70.3％)含有ESBLs酶的細(xì)菌中，有47株(67.1％，47/70)細(xì)菌呈現(xiàn)氨基糖苷類鈍化酶基因陽性，而31株非產(chǎn)ESBLs菌株中僅1株(3.3％

22、，1/31)細(xì)菌為氨基糖苷類鈍化酶基因陽性，兩組細(xì)菌的氨基糖苷類鈍化酶基因檢出陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001)。70株ESBLs陽性菌株中有13株(18.6％，13/70)細(xì)菌含氨基糖苷類甲基化酶基因，另外31株非產(chǎn)ESBLs菌株均未檢測到含氨基糖苷類甲基化酶基因菌株，兩組細(xì)菌的氨基糖苷類甲基化酶基因檢出陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。上述結(jié)果顯示產(chǎn)ESBLs菌株中產(chǎn)氨基糖苷類鈍化酶和氨基糖苷

23、類甲基化酶檢出率明顯高于非產(chǎn)ESBLs酶菌株，提示在產(chǎn)ESBLs酶菌株中易同時(shí)攜帶有氨基糖苷類鈍化酶基因和氨基糖苷類甲基化酶基因。
　　第三部分:陰溝腸桿菌耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移
　　為了解上述101株陰溝腸桿菌中耐藥質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性，選擇①44株同時(shí)含有ESBLs(SHV-12型及CTX-M型)及DHA-1型AmpC酶基因的菌株；②12株同時(shí)含SHV-12型ESBLs、DHA-1型AmpC、qnr、aac(6’)-Ib基因4種基

24、因的臨床菌株作為供體菌，對(duì)大腸埃希菌J53AzR進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)。
　　44株同時(shí)含有ESBLs及AmpC酶基因的菌株中有30株細(xì)菌發(fā)生了轉(zhuǎn)移接合，耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合發(fā)生率為70.5％(30/44)。經(jīng)對(duì)接合子的質(zhì)粒抽提結(jié)果顯示7株接合子與供體細(xì)菌一樣均只攜帶1個(gè)質(zhì)粒。對(duì)這7株接合子進(jìn)一步研究顯示①供體菌E-41×J53AzR→接合子41TC發(fā)生了CTX-M-1G基因的轉(zhuǎn)移接合；②供體菌E-57xJ53AzR→接合子57TC和

25、供體菌E-70×J53AzR→70TC發(fā)生了CTX-M-9G和aac(6’)-Ib基因的轉(zhuǎn)移接合；③供體菌E-91×J53AZR→接合子91TC和供體菌E-95xJ53AzR→95TC發(fā)生了qnrB、SHV-12、DHA-1和aac(6’)-Ib基因的轉(zhuǎn)移接合；④供體菌E-206×J53AzR→接合子206TC和供體菌E-209×J53AzR→209TC發(fā)生了CTX-M-9G和aac(6’)-Ib基因的轉(zhuǎn)移接合。轉(zhuǎn)移接合的結(jié)果提示①以上

26、CTX-M-1G、CTX-M-3G、CTX-M-9G、SHV-12型ESBLs及DHA-1型AmpC均具有可接合性。②依據(jù)7株接合子菌株均含有1個(gè)質(zhì)粒，故提示CTX-M-3G型和aac(6’)-Ib基因、CTX-M-9G和aac(6’)-Ib、SHV-12和aac(6’)-Ib基因可能位于同一質(zhì)粒上，發(fā)生共同轉(zhuǎn)移接合。7株接合子的頭孢噻肟和頭孢他啶的MIC值在4-32mg/L，與供體菌接近，較受體菌J53AzR(MIC值為≤0.06mg

27、/L)升高66.7-533倍，慶大霉素和阿米卡星的MIC值在4-128m/L(除1株41TC慶大霉素MIC為0.5mg/L)，較受體菌J53AzR(慶大霉素MIC值為0.125mg/L)升高16-1024倍。
　　12株同時(shí)含有qnrB、SHV-12、DHA-1和aac(6’)-Ib基因的臨床菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)后有7株細(xì)菌發(fā)生了轉(zhuǎn)移接合，耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合發(fā)生率為58.8％(7/12)。經(jīng)對(duì)接合子的質(zhì)粒抽提結(jié)果顯示：7株供體菌基因

28、型類似，均含有SHV-12、DHA-1、qnrB4、aac(6’)-Ib、ant(2")-Ⅰ基因，發(fā)生了SHV-12、DHA-1、qnrB4、aac(6’)-Ib基因的轉(zhuǎn)移接合，接合子的環(huán)丙沙星MIC值比受體菌J53AzR高12-24倍，為0.094mg/L～0.19mg/L，而受體菌的MIC值僅為0.008mg/L。這一結(jié)果同樣提示接合子對(duì)喹諾酮類敏感性的下降僅由qnrB基因所致，推測qnr可能是細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥性形成過程中最早出現(xiàn)

29、的耐藥耐藥機(jī)制。7株接合子的三代頭孢菌素的MIC值與供體菌接近，但較頭孢噻肟或頭孢他啶對(duì)受體菌J53AzR(≤0.06mg/L)的MIC值上升了66.7-1000倍，達(dá)到4mg/L～64mg/L，對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物慶大霉素和阿米卡星均較受體菌J53AzR(0.125mg/L～0.25mg/L)的MIC上升了16-1024倍，達(dá)到2mg/L～128mg/L。
　　第四部分:陰溝腸桿菌多重耐藥質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)分析
　　對(duì)上述研究

30、獲得的7株含qnrB基因、SHV-12、DHA-1及aac(6’)-Ib基因的轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行耐藥質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)及基因周邊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示：經(jīng)HindⅢ酶切、與載體PUC18連接，再經(jīng)酶切驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)一段約14kb的片段連接入載體PUC18中。對(duì)其中2株接合子質(zhì)粒65TC和404TC的14kb片段進(jìn)行了測序結(jié)果顯示2個(gè)接合子的DNA周邊結(jié)構(gòu)相同，且與本研究所前期報(bào)道的肺炎克雷伯中含qnrB4基因質(zhì)粒pSH7結(jié)構(gòu)相仿，包含有sapA-q

31、nrB4-pspF-spA-pspB-pspC-pspD-orf1-blaDHA-1-ampR基因序列。qnrB4基因上游為sapA基因，推測其編碼一個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)酶。pspF-pspA-pspB-pspC-pspD為psp操縱子，編碼一個(gè)噬菌體休克蛋白，其后為orf1讀碼框，之后為編碼AmpC酶的bladha-1基因及ampC的調(diào)控基因ampR。此外采用PCR檢測發(fā)現(xiàn)以上7株接合子及其供體菌均含有qac△1-sull耐消毒劑和磺胺基因、

32、整合子遺傳標(biāo)記IntegraseⅠ(整合酶基因)、Tn21/Tn501轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記(汞離子還原酶基因)基因，提示以上7株接合子除對(duì)三代頭孢菌素、氨基糖苷類耐藥外，還對(duì)季胺類消毒劑和磺胺耐藥，系多重耐藥質(zhì)粒，故以上7株接合子含有qnrB4基因、SHV-12、DHA-1、aac(6’)-Ib以及qac△1-sull耐消毒劑和磺胺基因、整合子遺傳標(biāo)記IntegraseⅠ(整合酶基因)、Tn21/Tn501轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記(汞離子還原酶基因)基