海洋真菌小分子代謝產(chǎn)物的快速提取方法研究及餾分制備.pdf

1、海洋真菌能夠產(chǎn)生各種各樣結(jié)構(gòu)類型的代謝產(chǎn)物，包括新的骨架和各種類型的取代基。海洋真菌既有不同的種屬，又有不同的來源。同一種屬的海洋真菌如果來源不同，很有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完全不同的代謝產(chǎn)物。粗略的統(tǒng)計表明，從海洋真菌發(fā)酵物中分離得到的新化合物，80％具有各種各樣的生物活性，海洋真菌是最具潛力的、可獲得具有生物醫(yī)學(xué)意義且結(jié)構(gòu)新穎的化合物的源頭微生物。本論文以海洋真菌固體發(fā)酵物為材料，針對大批量海洋真菌代謝產(chǎn)物的分離和純化需要開發(fā)高通量制備方法的

2、需求，開展小分子代謝產(chǎn)物快速提取與分離的技術(shù)方法研究，為海洋真菌小分子代謝產(chǎn)物餾分庫的建立、活性篩選提供前期準(zhǔn)備和技術(shù)與方法上的支持。至目前為止，已經(jīng)對一百多株海洋真菌發(fā)酵物做了提取、分離與制備的方法研究，本論文對其中的六株海洋真菌發(fā)酵物的萃取、分離以及餾分的制備作代表性的工作總結(jié)，主要的研究工作分為以下五部分:
　　 (1)以海洋真菌固體發(fā)酵物為起始研究對象，分別對固體發(fā)酵物濕樣（海洋真菌固體發(fā)酵后直接萃取，不用烘干）和固體發(fā)

3、酵物干樣（海洋真菌固體發(fā)酵后，先烘干，再進行萃?。┻M行萃取方法和萃取效率的研究對比。結(jié)果表明:無論是常壓或加壓萃取，海洋真菌固體發(fā)酵物濕樣直接萃取的萃取率明顯大于干樣萃取;從HPLC指紋圖譜上看，濕樣與干樣萃取得到的物質(zhì)組成相似，只是含量差別很大;采用氣相色譜對濕樣和干樣的萃取液進行檢測比較，濕樣萃取液中的一些組分在干樣萃取液中未檢測到，說明固體發(fā)酵物烘干過程損失掉了一些揮發(fā)性物質(zhì)。烘干步驟費時、費力、組分會丟失，所以選擇大米固體發(fā)酵物

4、濕樣直接萃取方法，有利于獲得較高的萃取率和萃取組分。
　　 (2)研究對比了乙酸乙酯萃取、乙酸乙酯和甲醇混合溶劑萃取、甲醇和乙酸乙酯依次萃取海洋真菌固體發(fā)酵物中小分子代謝產(chǎn)物的萃取率、溶劑回收率等指標(biāo)。研究結(jié)果表明:采用乙酸乙酯萃取，萃取率最低，為1.033％;乙酸乙酯、甲醇混合溶劑萃取法雖然萃取率提高了，為1.859％，但是大規(guī)模萃取時不利于溶劑的回收;甲醇、乙酸乙酯依次萃取方法萃取率最高，為3.036％，而且易于溶劑的分別回

5、收。所以萃取工藝選定為甲醇、乙酸乙酯依次萃取。
　　 (3)研究考察了在常壓條件下和加壓條件下甲醇、乙酸乙酯依次萃取海洋真菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中小分子代謝產(chǎn)物萃取率。首先對ASE（快速溶劑萃?。┓ǖ妮腿l件進行考察，并進行條件優(yōu)化，確定固體發(fā)酵產(chǎn)物采用甲醇萃取兩次后，再用乙酸乙酯萃取兩次;以萃取率和HPLC指紋圖譜為評價指標(biāo)，單因素試驗考察了萃取壓力、萃取溫度、靜態(tài)萃取時間等對萃取率的影響;通過單因素試驗結(jié)果確定正交實驗設(shè)計為3因素3

6、水平。正交實驗結(jié)果表明，ASE法萃取發(fā)酵物的最佳條件為:萃取壓力120bar，萃取溫度105℃，靜態(tài)萃取時間15min。按此最佳條件進行的萃取實驗，ASE法提取率可達到6.193％。其次對常壓萃取法和ASE法進行了對比。結(jié)果表明:ASE法與常壓萃取法相比，不僅萃取率高，萃取得到的物質(zhì)種類多，而且還能大大節(jié)約萃取時間，減少了有機溶劑的耗量。
　　 (4)以甲醇、乙酸乙酯依次萃取的甲醇萃取浸膏為研究對象，采用純水萃取浸膏，得到的水萃

7、取液用D101大孔吸附樹脂吸附洗脫處理，基本實現(xiàn)了甲醇萃取浸膏中大、小分子物質(zhì)的分離。首先對水的用量做了考察，菌號3A00235的菌株固體發(fā)酵物甲醇萃取浸膏，用350mL、250mL、250mL純水分三次提取，分別測定三份水萃取液中總糖、還原糖和蛋白含量。結(jié)果表明:第三次水提取液中蛋白質(zhì)、還原糖和總糖含量分別占各自總含量的5.552％、4.386％、4.564％，絕大部分水溶性大分子物質(zhì)可以被除去。其次對不同的大孔吸附樹脂SD300、D

8、M11、D101、AB-8、NKA-9、DA-201進行水提取液靜態(tài)吸附實驗，發(fā)現(xiàn)D101樹脂吸附蛋白和糖的能力較強，用純水洗脫時洗脫下來的極性較大的物質(zhì)含量較大，且甲醇洗脫液用HPLC檢測時發(fā)現(xiàn):當(dāng)檢測時間＜7min時，從色譜柱中流出的極性較大的物質(zhì)含量較低，而當(dāng)檢測時間＞40min時，從色譜柱中流出的極性較小的物質(zhì)含量最大。預(yù)示D101樹脂適宜作為海洋真菌小分子代謝產(chǎn)物的富集載體。通過單因素實驗確定了D101樹脂最佳的吸附分離條件是

9、:上樣濃度176.7mg/mL，上樣量2BV（體積比），上樣流速2BV/h，純水洗脫體積3/2BV。
　　 (5)以三株海洋真菌菌株（菌號3A00033、菌號3A00130和菌號3A00198）發(fā)酵物萃取、分離、制備為例，通過溶劑萃取固體發(fā)酵物、水萃取浸膏、大孔吸附樹脂處理水提取液、C18制備柱分離、硅膠柱分離等流程，完成了對海洋真菌代謝產(chǎn)物的分離制備，制備的各餾分基本按照物質(zhì)極性大小分段，各餾分的指紋圖譜色譜峰重疊率較低，預(yù)示