GADD34與eIF2α結(jié)合的研究及其生物學(xué)意義.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理功能，當(dāng)前的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)障礙與糖尿病、心腦組織缺血梗塞和退行性神經(jīng)疾病相關(guān)，可能是它們發(fā)病的重要原因。研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在生理條件下或壓力刺激下的反應(yīng)機(jī)理，對于理解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，尋找有效治療手段將產(chǎn)生重大影響。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)不能正常折疊、鈣失衡、蛋白質(zhì)糖基化受阻或不能形成正常的二硫鍵時，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，

2、ERS)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，PERK自磷酸化后激活，它能夠特異性的磷酸化eIF2α的51位的絲氨酸。磷酸化的eIF2α失去了啟動蛋白翻譯的能力。抑制蛋白合成，下調(diào)胞內(nèi)蛋白合成的整體水平，從而減輕了新生蛋白肽鏈對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊的負(fù)荷。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過較長時間應(yīng)激暴露后，會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)，如生長停滯與DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible gene34，GADD34)蛋

3、白的表達(dá)，它能夠作為一個調(diào)節(jié)亞基結(jié)合并指導(dǎo)PP1使磷酸化的eIF2α去磷酸化，使蛋白質(zhì)合成得以恢復(fù)。GADD34 C末端序列同單純皰疹病毒HSV的毒力因子ICP34.5的C端高度同源。GADD34的C端能夠在功能上替代ICP34.5的C端。這兩者的C端都含有一個與PP1結(jié)合的特定模序(R/K)VxF，都能夠作為調(diào)節(jié)亞基結(jié)合PP1調(diào)控eIF2α的磷酸化水平。本實(shí)驗室之前的研究揭示，ICP34.5能夠分別和PP1、eIF2α相互作用，調(diào)節(jié)P

4、P1和eIF2α之間的相互作用。三者會形成一個ICP34.5-PP1-eIF2α的大的復(fù)合物參與eIF2α的磷酸化水平調(diào)節(jié)。
　　 本文通過研究eIF2α在ICP34.5上的結(jié)合區(qū)域的功能發(fā)現(xiàn)，不能同eIF2α結(jié)合的ICP34.5突變體對于eIF2α的去磷酸化、病毒蛋白的合成和病毒的復(fù)制產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。證明了ICP34.5同eIF2α的結(jié)合對于其發(fā)揮生理功能是不可或缺的。在本實(shí)驗中，我首先用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗和免疫

5、共沉淀實(shí)驗證實(shí)了GADD34能夠介導(dǎo)PP1和eIF2α之間的相互作用。同時，發(fā)現(xiàn)GADD34能夠與eIF2α結(jié)合，且不依賴于GADD34對PP1的結(jié)合。該機(jī)制與我室先前已經(jīng)報道的ICP34.5的作用機(jī)制相一致。更進(jìn)一步的，我們通過序列比對找到了在GADD34上與ICP34.5上同eIF2α結(jié)合區(qū)域的同源序列，是GADD34的596-611氨基酸區(qū)段，然后通過雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗和免疫共沉淀實(shí)驗證實(shí)了該區(qū)段對于GADD34同eI

6、F2α的結(jié)合發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。通過蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，GADD34的596-611aa區(qū)域可能是一α螺旋，該區(qū)域的缺失可能導(dǎo)致GADD34蛋白不能正常折疊，無法形成自然構(gòu)象，從而影響了它和eIF2α的結(jié)合。同時，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺失了GADD34同eIF2α結(jié)合的關(guān)鍵性區(qū)域后，對于eIF2α去磷酸化的調(diào)節(jié)是有缺陷的。這一點(diǎn)和ICP34.5相一致。此外，我們還對GADD34與eIF2α的結(jié)合對細(xì)胞凋亡進(jìn)程的影響做了一定的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GADD3

7、4能夠促進(jìn)長時間ER stress誘導(dǎo)的凋亡，而當(dāng)GADD34不能結(jié)合eIF2α?xí)r更加促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。綜上，GADD34能夠通過結(jié)合PP1和eIF2α介導(dǎo)這兩者之間的相互作用，作為一個調(diào)節(jié)亞基調(diào)節(jié)了PP1的底物特異性。同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺失了與eIF2α結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域后，GADD34就失去了調(diào)控PP1使eIF2α去磷酸化的能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這一結(jié)合區(qū)域?qū)τ贕ADD34調(diào)控凋亡也起著很大作用。這些機(jī)理的研究，相信會為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的疾病的治療提