銅（Ⅱ）鎘（Ⅱ）、幾種小分子同血清白蛋白的相互作用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的功能分子，在所有的生命過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，具有運(yùn)載和儲(chǔ)存功能，其特定結(jié)構(gòu)與其生物功能密切相關(guān)。血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，它由一條單獨(dú)的氨基酸多肽鏈構(gòu)成，其三級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即domain Ⅰ、domain Ⅱ和domain Ⅲ。每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含A、B兩個(gè)亞區(qū)，以槽口相對(duì)的方式形成一種圓筒狀結(jié)構(gòu)。其中位于domain Ⅱ和domainⅢ的Site Ⅰ和Site Ⅲ兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與許多小分

2、子化合物具有較強(qiáng)結(jié)合能力，能夠與許多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)結(jié)合，起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。血清白蛋白具有許多重要的生理功能，可與許多化學(xué)物質(zhì)(如金屬離子、脂肪酸、氨基酸、激素、藥物及污染毒物等)以不同方式結(jié)合，并攜帶著這些物質(zhì)通過(guò)血液在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、運(yùn)輸、分配和代謝。通過(guò)研究化學(xué)物質(zhì)與血清白蛋白相互作用，可獲取化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝過(guò)程的重要信息。在金屬離子、藥物藥理和毒理研究、污染毒物的危害機(jī)理及基因變異研究等方面具有重要意義。

3、該領(lǐng)域已經(jīng)成為從事生命科學(xué)、化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)科研工作者共同關(guān)注的課題之一。本論文基于開展小分子與蛋白質(zhì)相互作用的重要意義及國(guó)內(nèi)外研究趨勢(shì)，在前人工作的基礎(chǔ)上，綜合利用熒光光譜、紫外一可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜((FTIR)、同步熒光光譜和三維熒光光譜，從以下幾方面進(jìn)行了研究： 在第一章的緒論中介紹了五個(gè)方面的內(nèi)容：1．概述；2．小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；3．小分子與蛋白質(zhì)相互作用獲取的信息；4．小分子與蛋白質(zhì)相互作用

4、的研究現(xiàn)狀；5．立題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容。重點(diǎn)介紹了小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究方法和手段及能夠獲取的信息。闡述了本論文的目的和意義，并對(duì)該方面未來(lái)的發(fā)展進(jìn)行了預(yù)測(cè)和展望。 在第二章中在模擬生理?xiàng)l件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下Cu(Ⅱ)對(duì)牛血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用熱力學(xué)公式

5、推導(dǎo)了兩者之間的相互作用力。研究中發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)對(duì)牛血清白蛋白BSA的內(nèi)源熒光猝滅以靜態(tài)猝滅為主，二者之間生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物是導(dǎo)致熒光猝滅的主要原因。Cu(Ⅱ)——牛血清蛋白相互作用過(guò)程是一個(gè)熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過(guò)程，二者之間的作用力以疏水作用力為主。Cu(Ⅱ)會(huì)導(dǎo)致血清蛋白色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近微環(huán)境極性增加，疏水性略有降低，使得牛血清白蛋白的肽鏈伸展，α-螺旋含量減少。紫外光譜法進(jìn)一步驗(yàn)證了Cu(Ⅱ)與

6、牛血清白蛋白之間的相互作用。通過(guò)改變激發(fā)波長(zhǎng)，采用熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對(duì)人血清白蛋白和牛血清白蛋白上的2種熒光基團(tuán)的猝滅情況及結(jié)合位點(diǎn)，紫外光譜法研究了二者共存時(shí)與血清白蛋白共有的結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。研究中發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對(duì)血清白蛋白的色氨酸殘基和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，Cu(Ⅱ)的猝滅程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Cd(Ⅱ)。Cu(Ⅱ)只與血清蛋白中214位色氨酸殘基發(fā)生作用，而Cd(Ⅱ)除了與血清白蛋白的214位發(fā)生作用外

7、，還和牛血清蛋白獨(dú)有的135位色氨酸殘基發(fā)生作用。Cu(Ⅱ)與Cd(Ⅱ)同時(shí)存在時(shí)Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的結(jié)合占主導(dǎo)作用。在第三章中在模擬生理?xiàng)l件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了雜多酸鹽K<,7>[PTi<,2>W<,10>O<,40>]·6H<,2>O(PM-19)與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下PM-19對(duì)兩種血清蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk

8、雙倒數(shù)方程和雙對(duì)數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲取了結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。并利用熱力學(xué)公式研究了PM-19與蛋白作用的熱力學(xué)參數(shù)及主要作用力類型。采用F6rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算了PM-19與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結(jié)合時(shí)結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用同步熒光光譜法探討了PM-19對(duì)血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)PM-19對(duì)血清蛋白的內(nèi)源熒光具有強(qiáng)烈的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致血清蛋白的內(nèi)源熒光猝滅的

9、主要原因。PM-19和血清蛋白形成的復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)在10<'4>-10<'6>L·mol<'-1>，表明兩者的結(jié)合較穩(wěn)定，說(shuō)明PM-19可被血清蛋白存儲(chǔ)和運(yùn)輸。與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.89和0.85。PM-19與牛血清白蛋白之間的主要作用力為靜電作用力；PM-19與人血清白蛋白之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。PM-19與牛血清蛋白的結(jié)合距離為為4.14nm；PM-19與人血清白蛋白中色氨酸殘基結(jié)合位置距離為

10、4.21nm。PM-19與血清蛋白的作用點(diǎn)位靠近色氨酸殘基，二者結(jié)合并不影響血清蛋白中熒光基團(tuán)色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的微環(huán)境，并不改變血清蛋白的構(gòu)象。 在第四章中，采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了4-硝基苯胺與血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下4-硝基苯胺對(duì)牛血清白蛋白和人血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用熱力學(xué)公式研究了4-硝基苯胺與蛋白作

11、用的熱力學(xué)參數(shù)及主要作用力的類型。采用Forster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算了4硝基苯胺與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結(jié)合時(shí)結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用紫外光譜法探討了4-4硝基苯胺對(duì)血清蛋白構(gòu)象的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了4-硝基苯胺對(duì)血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)4-硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復(fù)合物。其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，同時(shí)伴隨非輻射能量轉(zhuǎn)移。確定4-硝基苯胺與血清蛋白有一個(gè)結(jié)合位

12、點(diǎn)，其結(jié)合常數(shù)數(shù)量級(jí)為10<'4>L·mol<'-1>。4-硝基苯胺與血清蛋白相互作用過(guò)程是一個(gè)熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過(guò)程，二者之間主要靠靜電作用力和疏水作用力結(jié)合。4-硝基苯胺與牛血清蛋白的結(jié)合距離為3.87nm；4-硝基苯胺與人血清白蛋白中色氨酸殘基結(jié)合位置距離為3.76rim。4-硝基苯胺對(duì)血清蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得色氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強(qiáng)。4-硝基苯胺與血清蛋白的結(jié)合位點(diǎn)更

13、接近于色氨酸殘基。三維熒光光譜進(jìn)一步證明了4-硝基苯胺的加入使血清白蛋白的色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性減弱，破壞了血清白蛋白的有序結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)大分子更趨向于折疊態(tài)。第五章中采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白的相互作用。采用熒光方法中常用的Stem-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白結(jié)合時(shí)結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒

14、光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用紫外光譜法研究了不同濃度的2,4-二硝基苯胺對(duì)血清蛋白紫外吸收光譜的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了2,4-二硝基苯胺對(duì)血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)2,4-二硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復(fù)合物。其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，同時(shí)伴隨非輻射能量轉(zhuǎn)移。確定2,4-二硝基苯胺與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.17，2,4-二硝基苯胺與牛血清蛋白的結(jié)合距離為為3.13nm。2,4-二硝基苯胺對(duì)牛血清蛋白中的色氨

15、酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得酪氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強(qiáng)。三維熒光光譜進(jìn)一步證明了4-硝基苯胺的加入破壞了血清白蛋白的有序結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)大分子更趨向于折疊態(tài)。 第六章中，采用熒光光譜法分別研究了不同溫度下十六烷基三甲基溴化銨CTAB及十二烷基苯磺酸鈉SDBS與牛血清白蛋白的作用。采用紅外光譜法研究了十六烷基三甲基溴化銨對(duì)牛血清白蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)CTAB和SDBS均對(duì)BSA內(nèi)源熒光具有熒光猝滅作用。但兩者