植物谷胱甘肽合成酶(GSHI)的表達純化及其對溫度變化的應答.pdf

1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶GSHⅠ(γ-glutamylcysteine synthetaseγ-ECS)，又稱谷氨酰-L-半胱氨酸連接酶，是谷胱甘肽(GSH)合成過程第一步的催化酶，由于合成產物GSH可通過反饋抑制調控GSHⅠ的活性，GSHⅠ被認為是GSH生物合成途徑中的限速酶（在某些逆境條件下，如在Cd脅迫過程中GSHⅡ(GSH合成酶)可能成為GSH合成途徑的限制酶）。本論文將主要對GSHⅠ在溫度上的活性變化及其在轉錄水平上的響應進行

2、初步探索。
　　Ullmann等在1996年首次從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆了植物GSH合成酶基因。此后，植物谷胱甘肽合成酶基因陸續(xù)在豌豆（Pisum sativum）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max）、玉米(Zea mays)、小麥（Triticumaestivum）和百日菊(Zinnia elegans)等植物中被克隆。Bloch最早證實細胞內的

3、GSH是由GSHⅠ(EC6.3.2.2)與GSHⅡ(EC6.3.2.3)在ATP存在下催化L-谷氨酸(Glu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)的一個序貫反應合成的。因此，要實現GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供給是兩個必須滿足的條件。細胞內GSHⅠ活性提高使GSH合成加速，從而提高細胞內外GSH濃度。GSHⅠ活性的調節(jié)可在基因轉錄水平、轉錄后水平、翻譯后水平等環(huán)節(jié)，但主要在基因轉錄水平。
　　本論文

4、首次嘗試在pETM載體系統(tǒng)中進行擬南芥（Arabidopsis thaliana）的GSHⅠ和GSHⅡ的融合和非融合表達。從擬南芥的cDNA文庫中分別克隆GSHⅠ和GSHⅡ，采用原核表達技術，將其轉入pETM系列原核表達載體中，與載體中的硫氧還蛋白基因(TrxA)相融合，便于融合蛋白表達后的純化。SDS-PAGE分析表明，只有融合基因GSHⅠ-TrxA通過E.coli在適當溫度下經IPTG誘導后得到了過量表達的融合蛋白。
　　本論

5、文通過應用實時熒光定量PCR對煙草(Nicotiana megalosiphon)在極限溫度脅迫下進行相對定量。結果表明，煙草同擬南芥一樣在4℃低溫條件下，GSHⅠ被大量誘導表達，但是在40℃時表達受到抑制，表達量降低，其機理有待進一步的研究工作。
　　本實驗成功對擬南芥中的GSHⅠ進行了融合表達和純化，為了對GSHⅠ和GSHⅡ在細胞中的動態(tài)研究奠定基礎，對在一個質粒中同時表達兩個酶做了嘗試性的工作，并成功的表達了一個雙亞基的酶E

6、.coli Integration Host Factor(IHF);對在一個載體中同時表達合成鏈中兩個酶積累了實驗依據，對載體合成酶系構建提供了良好的基礎，也對用構建工程菌表達植物細胞內相互作用或關聯(lián)的蛋白或酶提供了很好的思路和方法，在植物基因工程研究方面具有重要的意義。同時，本論文首次對能夠誘導煙草谷胱甘肽合成酶表達的溫度進行了初步探索，證明了GSHⅠ可能具有協(xié)同抵御極限溫度脅迫的功能，為其在今后提高作物對環(huán)境抗逆作用的轉基因應用提