比較蛋白質(zhì)組學解析綠針假單胞菌G5菌株GacA功能.pdf

1、GacS/GacA雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)普遍存在于革蘭氏陰性細菌中，它主要通過控制RsmB家族sRNAs的轉(zhuǎn)錄拮抗翻譯抑制蛋白RsmA全局調(diào)控多種細菌生理活動和行為，包括運動性與生物膜形成、胞外酶、抗生素和植物生長素 IAA的產(chǎn)生等，與細菌的生防活性或致病性，以及細菌耐藥性、植物生長促進等密切相關。因此，在食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、醫(yī)療和生物制藥相關細菌的研究中受到廣泛關注。GacS/GacA系統(tǒng)由感應激酶GacS和反應調(diào)控子GacA組成，GacA

2、在不同細菌中高度保守，但 Gac系統(tǒng)調(diào)控的功能在不同細菌屬種或菌株中，以及不同生長環(huán)境中表現(xiàn)出明顯的差異。綠針假單胞菌G5是分離自香菜的內(nèi)生菌，前期研究表明G5能產(chǎn)生蛋白酶，幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素；以及氫氰酸（HCN），吩嗪和IAA等次生代謝物質(zhì)，具有生防活性和植物生長促進作用。然而在菌株 G5中GacA的調(diào)控作用目前尚不清楚。
　　本研究以綠針假單胞菌G5為目標菌株，利用差異蛋白質(zhì)組學方法首次全局解析了穩(wěn)定生長期gacA突變對全細胞蛋

3、白表達譜，以及外分泌蛋白表達譜的影響；并借助于生物信息學等方法對鑒定蛋白的功能進行了深入分析；進一步通過表型分析對GacA調(diào)控的關鍵差異蛋白點進行了驗證。以期更好地了解gacA在菌株G5中的生物學功能。GacA作為全局性調(diào)控子，研究其分子功能不僅可以進一步了解其復雜的級聯(lián)調(diào)控機制，也有利于從分子水平上改良G5的生防性狀。旨在為研發(fā)環(huán)境友好的多功能生物農(nóng)藥/肥料，保護生態(tài)、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，保障食品安全和人類健康奠定基礎。主要研究結果如

4、下：
　　1)野生菌G5和gacA突變體G5-6培養(yǎng)24h至穩(wěn)定期后，運用比較蛋白質(zhì)組學分析了gacA失活對全細胞蛋白和外分泌蛋白表達豐度的影響，質(zhì)譜鑒定出244個豐度變化2倍以上的蛋白點，代表著210種蛋白。和野生菌G5相比，gacA突變體全細胞蛋白中有38個點豐度上升，89個下降；細胞外分泌蛋白中91個蛋白點豐度上升，26個蛋白點豐度下降。
　　2) GO功能分析顯示這些差異蛋白點參與多種生物學過程，包括氨基酸、糖類、脂

5、、脂肪、核酸及無機物質(zhì)的代謝，蛋白質(zhì)的折疊與降解，底物轉(zhuǎn)運，分泌，信號轉(zhuǎn)導，防御反應和氧化還原脅迫等。在鑒定的蛋白中，39個蛋白點與脅迫反應相關，33個蛋白點與底物轉(zhuǎn)運有關，29個蛋白點與氨基酸合成代謝相關，26個蛋白點則參與了碳水化合物的代謝與能量轉(zhuǎn)換。KEGG分析顯示多個蛋白參與了TCA循環(huán)，糖酵解，糖異生等代謝通路。主要差異蛋白點描述如下：
　　3) GacA正調(diào)控G5菌株生防因子的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)組學分析表明與吩嗪抗生素生物合

6、成相關的蛋白PhzB、PhzF、PhzD和PhzO在突變體中均不表達。堿性蛋白酶AprA，幾丁質(zhì)酶ChiC_1、ChiC_2以及絲氨酸蛋白酶PspA、PspB的表達水平也顯著下降。表型分析表明gacA失活致使G5失去蛋白質(zhì)水解能力。
　　4) GacA正調(diào)控T6SS分泌系統(tǒng)的表達。gacA突變顯著降低了VI型分泌系統(tǒng)中TssC2、效應因子Hcp、Vgr家族蛋白的表達，暗示著GacA突變可能影響細菌與細菌之間，以及與植物寄主之間的相

7、互作用。
　　5) GacA與細菌生態(tài)適應性密切相關。嚴謹饑餓蛋白SspA及超氧化物歧化酶SodB在突變體中的表達量均升高10倍以上。表型分析證實了GacA負調(diào)控超氧化物歧化酶SOD及過氧化氫酶活性，可能影響細菌的脅迫耐受性。
　　6)四個與鞭毛合成與裝配相關的蛋白FliC、FlgK、FlgL和FliI在gacA突變體中的表達水平均升高。鞭毛提取組合SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定證實了GacA負調(diào)控鞭毛蛋白的合成。突變體中鞭毛蛋

8、白豐度增加，而細菌運動性下降表明細菌運動性受多種因素影響，并非完全依賴于鞭毛蛋白。
　　7) GacA突變改變了細胞外膜結構，導致了細胞壁肽聚糖合成蛋白Ddl和LPS脂多糖合成相關的LxpC蛋白表達水平升高。進一步Tricine SDS-PAGE分析證明了gacA突變體中脂多糖LPS合成增加。
　　8) gacA突變降低了植物生長素IAA合成相關的鄰氨基苯甲酸合成酶TrpE蛋白的表達水平。HPLC檢測證實gacA突變后IAA