缺血再灌注條件下BMP2-4參與腸黏膜屏障損傷的研究.pdf

1、研究背景:
　　腸道缺血再灌注損傷是一種常見的病理生理過程，許多疾病的病程中都會不同程度地伴隨缺血再灌注損傷，如腸系膜動脈栓塞、絞窄疝、充血性心力衰竭、嚴重創(chuàng)傷、失血性休克等，一些手術(shù)及臨床操作也可能導(dǎo)致缺血再灌注損傷，如大血管手術(shù)、小腸移植、心肺流轉(zhuǎn)術(shù)及血液透析等。急性腸缺血嚴重時可威脅到患者生命導(dǎo)致死亡，其死亡率約為60-80％，近年來腸缺血的發(fā)生呈不斷增加的趨勢，因此深入了解腸道缺血再灌注損傷的發(fā)生機制，有助于減輕缺血再灌注

2、損傷。
　　腸道缺血再灌注損傷的發(fā)生機制目前不甚清楚，相關(guān)學(xué)者先后提出氧自由基損傷、白細胞黏附與血管內(nèi)皮細胞損傷、炎癥介質(zhì)與細胞因子和細胞凋亡等一系列學(xué)說，而這些學(xué)說與缺血再灌注時NF-κB信號的激活從而導(dǎo)致各種損害因子的出現(xiàn)有著重要的聯(lián)系，NF-κB是參與炎癥基因（如黏附分子、細胞因子、酶等）表達、細胞凋亡、細胞增殖與分化、氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多生物過程的一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。腸黏膜屏障功能的損害包括缺血再灌注時各種炎癥介質(zhì)的釋

3、放所導(dǎo)致的腸黏膜上皮通透性增加，還包括缺血再灌注時腸上皮細胞間的緊密連接蛋白等物理屏障損害導(dǎo)致的細胞間隙增加，從而造成細菌及腸道的有害物質(zhì)進入到血液中引起嚴重的全身炎癥反應(yīng)。
　　目的：本文就是圍繞缺血再灌注時NF-κB信號激活及緊密連接蛋白破壞這一問題而展開研究的。
　　方法:
　　1.制作腸上皮細胞缺氧模型及大鼠腸缺血再灌注損傷模型，腸上皮細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)6小時后(1％O2，5％CO2)，加入裂解液提取蛋白

4、。1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，常規(guī)脫毛備皮后，取腹部正中切口，沿腹白線剪開腹膜，用血管夾夾閉腸系膜上動脈20分鐘，松開血管夾恢復(fù)血管灌注1小時后處死大鼠，取上段空腸制作切片。Western-bolt、免疫熒光檢測腸上皮細胞內(nèi)的BMP信號通路的表達變化。
　　2.腸上皮細胞IEC-6接種至培養(yǎng)板內(nèi)，加入外源性BMP2、BMP4蛋白刺激細胞，同時加入BMP信號通路特異性性拮抗劑noggin蛋白，并且大鼠腹腔內(nèi)注射noggin蛋白

5、預(yù)處理30分鐘后再接受缺血再灌注損傷，Sham組及缺血再灌注組作為對照，Western-bolt、免疫熒光檢測腸上皮細胞內(nèi)NF-κB信號通路的表達變化。
　　3.RT-PCR檢測腸上皮細胞外源性BMP2、BMP4及noggin蛋白刺激后，細胞內(nèi)TNF-a、IL-6等炎癥基因的表達變化水平。
　　4.Western-bolt檢測外源性BMP2、BMP4對腸上皮細胞IEC-6內(nèi)AKT信號及緊密連接蛋白occludin表達變化的影

6、響。
　　結(jié)果:
　　1.腸上皮細胞缺氧培養(yǎng)6小時后，細胞內(nèi)的BMP2、BMP4與對照組比較表達增加，受體BMPRⅠa、BMPRⅡ表達上調(diào)，同時免疫熒光實驗觀察到，腸絨毛內(nèi)的BMP2、BMP4、BMPRⅠa、BMPRⅡ熒光信號在缺血再灌注后較Sham組明顯增強。
　　2.外源性的BMP2、BMP4可直接激活腸上皮細胞內(nèi)的NF-κB信號，免疫熒光實驗觀察到NF-κB發(fā)生磷酸化后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與調(diào)控，而BMP信號通路的特異性

7、拮抗劑noggin蛋白可部分逆轉(zhuǎn)NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。動物模型內(nèi)缺血再灌注組腸上皮細胞內(nèi)NF-κB信號明顯激活，而予noggin蛋白預(yù)處理30分鐘組的大鼠NF-κB信號激活水平降低。
　　3.外源性BMP2、BMP4可誘導(dǎo)IEC-6細胞內(nèi)的TNF-a、IL-6的表達，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，noggin蛋白可減少TNF-a、IL-6的產(chǎn)生。
　　4.AKT信號在加入BMP2、BMP4刺激30分鐘時磷酸化水平明顯增加，細胞間緊密連

8、接蛋白occludin在加入BMP2、BMP4培養(yǎng)24小時后，蛋白表達水平明顯降低，BMP信號的特異性拮抗劑noggin蛋白及NF-κB通路的阻斷劑PDTC都可阻止occludin蛋白的減少。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧及缺氧再灌注條件下，腸上皮細胞內(nèi)的BMP2、BMP4蛋白表達增加，受體BMPRⅠa、BMPRⅡ表達上調(diào)。在小腸絨毛組織內(nèi)，BMP2及BMP4在絨毛頂端增加最明顯，而基底及隱窩處增加較弱。
　　2.BMP2