丙酮酸鹽對大鼠小腸缺血再灌注引起的腸屏障損傷的保護作用及機制的研究.pdf

1、目的:近年來的研究發(fā)現(xiàn)靜脈或腸內給予丙酮酸鈉能夠減輕燒傷和失血性休克等引起的腸屏障損傷和遠隔器官功能障礙，但是其潛在的機制尚不清楚;最近的研究證實丙酮酸鹽能夠增加缺氧誘導因子1(HIF-1)的表達，減輕缺血再灌注(I/R)引發(fā)的器官組織損傷。因此，本研究假設丙酮酸可能通過上調腸I/R時HIF-1信號通路及其下游靶基因的表達，影響腸上皮細胞的屏障功能。本研究目的:1.采用空腸袋缺血再灌注模型，比較丙酮酸鹽溶液、葡萄糖溶液和枸櫞酸鹽溶液對I

2、/R引起的腸屏障損害的保護作用;2.研究腸I/R時丙酮酸鹽通過上調HIF-1及其下游靶基因的表達、影響腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1表達的機制。
　　 方法:
　　 1.實驗動物及分組:120只清潔級大鼠，體重220g-260g，購入后適應性飼養(yǎng)1周。術前12小時禁食，自由飲水。實驗動物隨機分為①正常對照組（S組）②丙酮酸鈉組(IP組)③葡萄糖組(IG組)④枸櫞酸鈉組(IC組)⑤生理鹽水對照組(IS組);分三個時間點:缺

3、血30min(I30)、缺血60min(I60)和缺血60min后再灌注30min(R30)，每個時間點8只大鼠。
　　 2.大鼠腸袋I/R模型:鹽酸氯胺酮注射液與速眠新Ⅱ注射液按體積比2∶1混合，0.5mL/kg腹部注射麻醉后，用保溫毯維持體溫在37℃左右。在麻醉狀態(tài)下沿腹白線行無菌開腹手術，游離屈氏韌帶遠端5cm的空腸，制作8cm大小的腸袋，近端置入激光多普勒血流儀用絲線結扎固定，遠端結扎，往腸內灌注入液體（生理鹽水、丙酮酸

4、鈉溶液10mmol/L、葡萄糖溶液10mmol/L或者枸櫞酸鈉溶液10mmol/L），行腸系膜上動脈分離，用無傷動脈夾夾閉腸系膜上動脈起始部，夾閉30min或者60min，或者夾閉60min后恢復血流30min，制成本模型的三個時間點。在夾閉腸系膜上動脈后，I30、I60和R30檢測腸粘膜血流量。實驗終點通過腹主動脈放血法處死大鼠。正常對照組進行手術操作，制作腸袋，不夾閉腸系膜上動脈。
　　 指標檢測與方法:①腸黏膜損傷形態(tài)學觀

5、察和評分;②測定小腸黏膜屏障功能指標二胺氧化酶(DAO);③小腸黏膜屏障功能指標:采用免疫熒光雙標法標記和激光共聚焦顯微鏡觀察腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化;④Westernblot方法檢測腸組織ZO-1、HIF-1、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK1)及促紅細胞生成素(EPO)表達;⑤測定誘生型和內皮型一氧化氮合酶（iNOS和eNOS），一氧化氮(NO);⑥激光多普勒血流儀監(jiān)測腸黏膜血流量(IMBF);⑦腸組織過氧化指標:丙二醛(M

6、DA)含量、黃嘌呤氧化酶(XOD)活性和過氧化氫(H2O2);
　　 結果:
　　 1.腸黏膜損傷病理評分，各組在腸系膜上動脈夾閉后，出現(xiàn)明顯的損傷，各時間點絨毛損傷不一樣，IP組在各個時間點的絨毛損傷明顯較其他各組輕，IG組與IS組相比絨毛損傷較輕，IC組與IS組比較損傷無明顯差別。
　　 2.DAO:腸缺血在灌注損傷后，DAO活性較S組明顯降低，IP口組較其他缺血損傷組DAO含量顯著增高(P＜0.05)，IG

7、組較IS組DAO含量顯著增高(P＜0.05)，IC與IS組比較損傷無明顯差別。
　　 3.緊密連接蛋白ZO-1:(1)通過免疫印跡法分析ZO-1蛋白條帶平均光密度值，與正常組比較，缺血再灌注損傷后各組蛋白表達較S組明顯降低;IP組顯著高于其他各損傷組，IG組較IS組高，IC組與IS組相比較無明顯差別;(2)S組腸粘膜ZO-1蛋白陽性表達，熒光信號強，呈緊密連接;而其它各實驗組的熒光信號則相對不明顯，呈現(xiàn)斷裂連接，提示ZO-1蛋白

8、重新分布或表達降低。IS組的ZO-1蛋白明顯減少，甚至消失;IP組的ZO-1蛋白表達低于正常組，但是較其他各組明顯增多;IP組ZO-1蛋白表達比IS組明顯增多，熒光信號較強。
　　 4.Westernblot:腸組織缺血情況下，較S組HIF-1表達顯著增多，HIF-1誘導下游靶基因表達也增多。IP組較其他各組HIF-1的表達明顯增多，IG組與IS組相比HIF-1表達增加，IC組與IS組之間無明顯差別;在HIF-1的誘導下，IP組

9、的PDK1和EPO的表達較其他組也明顯增加，IG組與IS組比較PDK1和EPO表達增加，IC組與IS組之間無明顯差別。
　　 5.eNOS、iNOS和NO:缺血再灌注損傷后各組eNOS和iNOS活性均明顯升高，各組eNOS和iNOS活性之和無明顯差別，IS組eNOS活性顯著低于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS組與IC組間無明顯差別;IS組iNOS活性高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS

10、組與IC組間無明顯差別;IS組NO活性顯著低于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS與IC組間無明顯差別。
　　 6.IMBF值:與S組比較，夾閉腸系膜上動脈后各缺血組IMBF明顯下降;IP組與IS組比較IMBF顯著回升(P＜0.01);IG與IS組比較IMBF明顯回升(P＜0.05)，IC與IS組間沒明顯差別。
　　 7.XOD、H2O2和MDA:缺血再灌注損傷后各組腸組織XOD、H2O2和MDA含量均

11、明顯升高，與損傷程度成正相關;IS組XOD活性顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS組與IC組間無明顯差別;IS組H2O2含量顯著高于顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，IC組與IS組相比H2O2含量明顯較多(P＜0.05);IS組MDA含量顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，IC組與IS組比較MDA含量明顯較多（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1.丙