缺血再灌注條件下IEC來源的BMP4和Il-7相互作用調(diào)節(jié)IEL凋亡研究.pdf

1、目的：
　　腸缺血再灌注損傷(ischemic/reperfusion，I/R)是在嚴重感染、創(chuàng)傷、心肺功能不全、器官移植等的過程中常見組織器官損傷之一。腸粘膜屏障是一個復雜的屏障結(jié)構(gòu)，主要由機械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學屏障等不同組分組成。其中由腸上皮細胞（intestinal epithelial cell，IEC）和腸上皮間淋巴細胞(intestianl intr aepitheliallymphocytes，IEL)為

2、主組成的機械屏障和免疫屏障是決定腸屏障功能的核心因素。IEL作為一群主要由T淋巴細胞組成的特殊細胞群構(gòu)建的腸免疫屏障，IEC與IEL相互緊密，IEC可通過分泌的蛋白因子直接接觸作用于IELs，調(diào)控IEL的增殖、分化、凋亡等。因此深入研究探討IEC對IEL的調(diào)控機制，將有助于闡明應激條件下腸粘膜屏障功能障礙的發(fā)病機制。
　　在腸道遭受到I/R損傷后，腸粘膜屏障在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、阻礙內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移等功能受到限制，其中最主要的原因是腸上

3、皮細胞和腸上皮間淋巴細胞組成的機械屏障、免疫屏障受到極大破壞。前期研究發(fā)現(xiàn)小腸在胃腸外營養(yǎng)、缺氧、缺血再灌注刺激下腸黏膜上皮細胞內(nèi)BMP4蛋白分泌表達增加，BMP4通過傳導下游信號可促進促炎因子的釋放，進一步加重腸黏膜屏障功能損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)胸腺上皮細胞來源的BMP4可通過Smad信號影響前體細胞CD34+的成熟，進而抑制胸腺內(nèi)T淋巴細胞的分化，使機體的免疫功能下降，而IL-7可以抵消BMP4對CD34+的影響。IELs作為腸道特殊免

4、疫淋巴細胞，在維持腸黏膜免疫屏障功能穩(wěn)定起重要作用。在TPN和I/R刺激下，IEL的功能降低、數(shù)量減少、凋亡增加使腸黏膜屏障功能障礙加重。為了進一步研究在缺血再灌注下腸上皮細胞對腸上皮間淋巴細胞的調(diào)控機制。因此，本文擬通過體外實驗檢測在缺血再灌注刺激下腸上皮細胞來源的BMP4和IL-7相互作用調(diào)節(jié)腸上皮間淋巴細胞凋亡的研究而展開的，為在缺血再灌注下IEC-IEL的對話機制研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.制作小鼠

5、腸I/R損傷模型，6小時后頸椎脫臼處死小鼠，取出小腸上段空腸組織制作石蠟切片和冰凍切片，HE染色觀察腸黏膜絨毛形態(tài)學變化，免疫熒光技術(shù)檢測腸上皮細胞內(nèi)BMP4、IL-7蛋白表達變化。
　　2.將小鼠頸椎脫臼處死，取全程小腸，提取小鼠腸IEL細胞，采用RT-PCR、流式細胞術(shù)驗證IEL中存在BMP信號通路蛋白表達。
　　3.將小鼠缺血再灌注處理6小時后，提取腸上皮間淋巴細胞，用Sham作為對照組，用流式細胞術(shù)檢測在IEL中BM

6、P和IL-7信號通路蛋白表達變化。
　　4.將提取的IEL單獨培養(yǎng)，加入外源性BMP4、IL-7蛋白，采用流式細胞術(shù)檢測IEL的凋亡率表達變化。
　　5.給予外源性IL-7蛋白刺激IEC-6、IEL后，Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)BMP4、p-NF-kB蛋白表達變化。
　　6.在IEC-6、IEL中給予外源性BMP4蛋白刺激后，Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)IL-7、IL-7R/CD127蛋白

7、表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.腸缺血再灌注處理6小時后，光鏡下發(fā)現(xiàn)腸黏膜部分絨毛斷裂、細胞脫落、部分結(jié)構(gòu)消失。同時，免疫熒光技術(shù)觀察到腸IEC內(nèi)BMP4蛋白表達明顯增強，絨毛內(nèi)的IL-7蛋白表達明顯減少。
　　2.在IEL中通過RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)存在BMP經(jīng)典信號通路關(guān)鍵分子BMPRIA、BMPRIB、Smad1、Smad5、Smad8、p-NF-kB的表達，同時用流式技術(shù)驗證IEL中存在BMPRIA、B

8、MPRIB、p-NF-kB的表達。
　　3.小鼠小腸在缺血再灌注條件下，IEL中BMPRIA、BMPRIB、P-Smad1/5、p-NF-kB表達量較Sham組明顯增高，同時IL-7R/CD127、P-STAT5表達明顯減少。
　　4.給予外源性BMP4刺激后，可誘導IEL的凋亡率增加。給予NOGGIN、PDTC、IL-7聯(lián)合刺激后，IEL中的IEL凋亡率與Control組無明顯差異。
　　5.在IL-7刺激下，IEC

9、中BMP4表達下調(diào)，IEL中BMP信號下調(diào)。
　　6.給予外源性BMP4刺激下，IEC-6中IL-7蛋白表達下調(diào)，在IEL中的IL-7R/CD127及P-STAT5蛋白表達減少.
　　結(jié)論：
　　1.在I/R損傷刺激下，腸黏膜部分絨毛斷裂、細胞脫落、結(jié)構(gòu)消失，腸屏障功能遭到極大破壞;腸黏膜上皮細胞內(nèi)BMP4蛋白表達增加、IL-7表達減弱。
　　2.IEL中存在BMP信號通路表達，且在腸I/R損傷刺激下IEL內(nèi)BM