甘草成分作為心臟保護液添加劑延長大鼠供心冷缺血時間及機制研究.pdf

1、心臟移植作為終末期心衰最有效的治療手段，一方面能使患者的生存率顯著提高，延長患者壽命，同時，可以使患者的生活質量得到明顯改善。然而，由于供心數(shù)量的嚴重匱乏，為心臟移植手術的開展造成極大的障礙。因此，采取適當方式來延長供心的冷缺血時間，是擴大供心獲取半徑和增加供心數(shù)量的可能途徑。研究表明，供心的保護效果極大影響著移植后供心的功能，影響患者的預后。因此，尋找更佳的供體心臟保存方法以延長供心冷缺血時間就顯得尤為重要。
　　HTK液（Hi

2、stidine-tryptophane-ketoglutarate solution，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液）是目前廣泛應用的離體器官冷藏保護液，可代償心肌細胞酸中毒和延長無氧糖酵解時間，具有良好的心肌保護作用。近年來，臨床研究表明, HTK液雖然有很好的心肌保護作用，但是仍然不能完全保證心臟移植手術的成功，主要是因為心臟移植手術的過程中會發(fā)生缺血/再灌注(I/R)損傷。因此，探索更有效的預防心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護方法和研

3、制新型心臟保護液配方是研究的熱點。
　　在我國傳統(tǒng)中藥寶庫中，很多中藥都有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，這使在中藥中篩選出一種減輕心肌1/R損傷的中藥成為了可能。研究表明甘草具有很多藥理學活性，如抗心肌缺血、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎作用等。在我們的以前研究中發(fā)現(xiàn)，甘草中多種化合物，如甘草查爾酮B(LCB)、甘草查爾酮C(LCC)、山奈酚(Kae)和迷迭香酸(RosA)等，均有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，并且這些化合物均能

4、顯著減輕心肌I/R損傷。
　　通過我們的研究結果，以及相關的文獻報道，我們推斷甘草提取物可作為傳統(tǒng)HTK液的添加劑，可能有增強心臟保護液對心肌的保護作用，從而延長供心冷缺血時間。因此，我們在傳統(tǒng)HTK液中分別添加RosA、Kae、LCB和LCC，形成4種新的心臟保護液，并通過大鼠供心冷缺血模型、供心心臟移植模型及大鼠心肌缺血/再灌注模型，觀察其對心肌超微結構改變和移植術后大鼠生存率、心功能影響，選出增強HTK液功效最有效的藥物，以

5、及對新型HTK液通過干擾PPAR-γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ）/NF-κB的途徑減輕冷缺血損傷的作用機制進行探討。
　　第一部分:甘草提取物延長供心冷缺血時間的研究
　　目的：
　　以離體大鼠的供心為研究對象，通過建立供心冷缺血保存模型和心臟移植模型完成供心的灌注、保存及移植，觀察含有不同甘草提取物成分的HTK液的

6、心肌保護效果。
　　方法：
　　將500只雄性近交系SD大鼠隨機分為供體組400只、受體組100只。供體組隨機分為4組，即冷缺血4h組、6h組、8h組、10h組，每組再隨機分為5小組，即HTK液組、RosA組（含有15μmol/L RosA的HTK液）、Kae組（含有15mmol/L Kae的HTK液）、LCB組（含有1μg/L LCB的HTK液）及LCC組（含有2mmol/L LCC的HTK液），每小組20只。受體組也隨機

7、分為4大組，每組再隨機分為5小組，每小組5只。供體組400只大鼠在全麻手術下切取供心。各供心組大鼠心臟使用該組對應的含藥HTK液(4℃)進行灌流停搏，心臟停搏后，立刻切取下，分別置于5種4℃的HTK液中保存4h、6h、8h、10h。冷缺血保存后，對供心進行再灌注并檢測相關心功能指標（射血分數(shù)）。HE染色觀察心肌組織學結構損傷，透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。同時，在不同冷缺血時間點，檢測各組心臟保護液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌

8、鈣蛋白Ⅰ(CTnⅠ)的含量;檢測移植術后供心射血分數(shù)及大鼠存活率;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色估計心肌梗死而積。
　　結果：
　　1、隨冷缺血時間的延長，5種不同HTK液中心肌梗死面積逐漸升高，并且HTK液中的心肌酶（CK-MB和CTnⅠ）含量也逐漸升高。供心冷缺血時間6h以內，5種不同HTK液中心臟損傷數(shù)據(jù)沒有顯著性差異(P＞0.05)。供心冷缺血時間大于6h時，RosA組與Kae組心肌損傷程度均顯著低于HT

9、K液組（P＜0.05），主要表現(xiàn)為:RosA組與Kae組中心肌梗死面積和HTK液中心肌酶的含量均顯著低于HTK液組(P＜0.05)。
　　2、心肌細胞形態(tài)結構變化的比較:供心冷缺血時間6h以內，在光鏡下各組心肌細胞形態(tài)基本保持正常，細胞間質出現(xiàn)輕度水腫，肌原纖維排列整齊，有少許溶解;供心冷缺血時間超出6h以上時，細胞間質出現(xiàn)中度水腫，部分纖維斷裂、溶解。與HTK液組相比，RosA組與Kae組心肌細胞形態(tài)結構損傷明顯減輕。
　

10、　3、心肌細胞超微結構變化的比較:供心冷缺血時間6h以內，電鏡下各組心肌細胞膜基本完整，細胞基質輕度腫脹，肌絲、肌節(jié)結構清晰，排列整齊，細胞核無腫脹，染色質均勻，核周無水腫帶;供心冷缺血時間大于6h時，心肌細胞出現(xiàn)明顯的損傷，少量心肌細胞有自溶現(xiàn)象出現(xiàn)，肌絲、肌節(jié)排列欠整齊，存在不同程度的紊亂，并開始出現(xiàn)空泡樣變。RosA組顯示出與其他組相比更好的心肌保護作用。
　　4、心肌梗死面積的檢測:以供心冷缺血時間8 h TTC染色為代表

11、，HTK液組顯著高于RosA組，高于Kae組、LCB組及LCC組。
　　5、受體大鼠生存率的比較:供心冷缺血時間6h以內，各組大鼠2個月生存率無明顯差別。當供心冷缺血時間大于6h，與HTK組相比，RosA組大鼠生存率顯著提高（P＜0.05），并且RosA組大鼠的心臟射血分數(shù)也顯著高于HTK液組(P＜0.05)。
　　6、供心心功能的比較。與HTK組相比，RosA組在早期再灌注階段顯著改善心功能（心臟射血分數(shù)）(p＜0.01)

12、。添加Kae和LCB的HTK液也提高了心肌保護的效應(p＜0.05)。
　　結論：
　　1、隨冷缺血時間的延長，心肌損傷逐漸加重，移植后供心射血分數(shù)下降，大鼠生存率降低。
　　2、RoaA作為HTK液添加劑，具有延長心肌冷缺血時間、減輕心肌損傷、提高移植后心臟的射血分數(shù)及大鼠生存率。
　　3、RosA組心肌保護液效果優(yōu)于傳統(tǒng)HTK液組和其他添加劑組。
　　第二部分 迷迭香酸心肌保護作用機制研究
　　目

13、的：
　　探討迷迭香酸(RosA)作為HTK液添加劑增強心肌保護的作用及其機制。
　　方法：
　　成年SD大鼠隨機分為六組，假手術組（Sham組）、冷缺血/再灌注損傷組（I/R組）、RosA組、GW組(GW組，GW9662是PPAR-γ的選擇性阻斷劑)、RosA+冷缺血/再灌注損傷組（RosA+I/R組）、RosA+GW9662+冷缺血/再灌注損傷組（RosA+GW+I/R組）。在冷缺血保存4小時后，鼠心通過Lange

14、ndorff灌流系統(tǒng)進行復灌。血流動力學參數(shù)由生物多導記錄儀檢測;測定灌注前后冠狀動脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量。灌注結束，心肌梗死面積用TTC染色進行檢測;心肌組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物的比率(GSH/GSSG)用ELISA法測定;PPAR-γ和NF-κB的蛋白質的表達量通過Wes

15、tern blot法進行測定;心肌細胞凋亡率通過TUNEL法檢測。
　　結果：
　　與假手術組比較，I/R組心臟血流動力學參數(shù)均顯著降低，心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率均顯著增加，冠脈流出液中的LDH和CK含量顯著升高，心肌組織中MDA、CRP、IL-6和TNF-α含量顯著升高，而SOD的活性顯著性降低。RosA和GW組與假手術組之間沒有顯著性差異。與I/R組相比，RosA+I/R組中心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率、心肌組織中S

16、OD活性，GSH/GSSG比率和心臟血流動力學系數(shù)顯著升高，冠狀動脈流出液中心肌酶含量降低，心肌組織中MDA、CRP、IL-6和TNF-α的含量也顯著降低。并且PPAR-γ的蛋白表達量顯著性升高，而NF-κB的蛋白表達量顯著降低。重要的是，RosA的上述效應幾乎全部被共同添加的GW9662逆轉。
　　結論：
　　1、心臟經(jīng)冷缺血保存4h后，再灌注損傷表現(xiàn)為心肌收縮功能下降、心肌組織壞死加重、氧化應激水平升高、炎癥因子分泌增加