蜘蛛毒素與電壓門控離子通道作用機制研究.pdf

1、Jingzhaotoxin-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)是從我國特有的敬釗纓毛蛛中分離得到的一種多肽毒素，它能夠選擇性的作用于大鼠心肌細胞并使心肌鈉離子通道的激活往去極化方向漂移。我們采用酵母發(fā)酵系統成功的表達了JZTX-Ⅲ以及其18個突變體，其中除F7A表達量太低外其他的突變體表達量約為4 mg/L。表達的JZTX-Ⅲ以及突變體的CD圖譜和天然JZTX-Ⅲ的基本一致，因此CD譜檢測證明表達的毒素以及突變體并沒有發(fā)生結構的改變。膜片鉗檢測發(fā)現表達

2、的JZTX-Ⅲ能夠選擇性的抑制Nav1.5電流(IC50為348.0±67.9 nM)，同時毒素能使Nav1.5往去極化方向漂移約+13 mV但不改變鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活。因此，表達的JZTX-Ⅲ和天然的JZTX-Ⅲ在結構和功能上都保持一致。檢測毒素突變體和Nav1.5的親和力發(fā)現，兩個酸性殘基(Asp1、Glu3)和一個暴露在毒素表面由色氨酸構成的疏水性斑片(Trp8、Trp9、Trp28、Trp29、Trp30)是JZTX-Ⅲ和Nav1

3、.5作用的關鍵殘基，另外一個堿性殘基Arg13突變成Glu后使毒素和通道的親和力增強了十倍。對Nav1.5 DII S3-S4連接環(huán)上的氨基酸殘基進行了丙氨酸掃描后，發(fā)現Nav1.5的突變體S799A、R800A、L804A能顯著的降低JZTX-Ⅲ和Nav1.5的親和力，這些氨基酸殘基可能是JZTX-Ⅲ結合鈉通道的關鍵殘基。將Nav1.5和其他鈉通道亞型的DIIS3-S4氨基酸序列對比，發(fā)現R800為Nav1.5所特有的氨基酸。Nav1

4、.7上相應的位點D816突變成D816R增強了JZTX-Ⅲ和Nav1.7的親和力，Nav1.5突變體R800D使毒素和通道的親和力降低約72倍。JZTX-Ⅲ通過酸性氨基酸殘基和Nav1.5 DII S3-S4鏈接環(huán)上的堿性氨基酸殘基相互作用，這種作用機制不同于以往的毒素，因此JZTX-Ⅲ可以作為毒素和鈉通道結構和功能研究的工具試劑。
　　 Huwentoxin-Ⅳ(MHWTX-Ⅳ)修飾體是從虎紋捕鳥蛛粗毒中分離得到的一種發(fā)生翻譯

5、后修飾的毒素。質譜檢測表明mHWTX-Ⅳ分子量比天然HWTX-Ⅳ的分子量少18 Da。采用質譜進一步的分析毒素的氨基酸序列，發(fā)現HWTX-Ⅳ的N端谷氨酸脫水環(huán)化形成焦谷氨酸導致分子量減少18 Da。全細胞膜片鉗顯示，MHWTX-Ⅳ選擇性的抑制大鼠DRG神經元上的TTX-S鈉離子通道(IC50～54.16±7.3 nM)，而對大鼠DRG細胞的TTX-R鈉離子通道以及其他的電壓門控離子通道都沒有影響。和天然HWTX-Ⅳ一樣，HWTX-Ⅳ修飾

6、體不改變TTX-S鈉離子通道的I-V曲線、電導曲線以及穩(wěn)態(tài)失活曲線。HWTX-Ⅳ抑制的鈉離子通道在高電壓刺激下與鈉離子通道解離，鈉電流基本完全恢復，但被HWTX-Ⅳ修飾體抑制的鈉電流在高電壓(+200 mv，500 ms)刺激下依然沒有恢復，證明HWTX-Ⅳ修飾體在高電壓的刺激下與鈉離子通道依然緊密結合。這有可能是谷氨酸環(huán)化形成焦谷氨酸后導致毒素缺失一個負電荷，從而使毒素和鈉通道上的負電荷殘基的結合更加緊密。這是第一次報道在蜘蛛毒素中有

7、焦谷氨酸的存在，并且第一次證明焦谷氨酸能夠增強HWTX-Ⅳ修飾體和鈉離子通道的結合。
　　 JZTX-34是敬釗纓毛蛛中分離得到一種新的多肽毒素，由于該毒素在粗度中的含量較小，因此采用釀酒酵母表達該毒素。JZTX-34含有35個氨基酸殘基其中包括三對半胱氨酸形成二硫鍵，推測其可能為ICK結構模體的多肽毒素。JZTX-34能選擇性作用于大鼠DRG細胞上的TTX-S鈉通道(IC50～85 nM)，但是對TTX-R鈉通道以及鈣通道和鉀

8、通道無明顯抑制作用。JZTX-34能選擇性抑制大鼠DRG細胞上的TTX-S鈉電流并使鈉通道穩(wěn)態(tài)失活往去極化方向漂移10 mV，但是毒素卻不改變鈉通道的激活。JZTX-34在高電壓刺激(+120 mv)下與鈉通道發(fā)生解離，抑制消除。因此，我們推測JZTX-34是一個位點4的毒素可能結合鈉通道的電壓敏感元件。
　　 虎紋捕鳥蛛(Ornithoctonus huwena)是分布于我國南方毒性最強的蜘蛛之一，其毒液中含有大量的多肽毒素能

9、夠快速的殺死獵物。HWTX-Ⅰ和HWTX-Ⅱ是虎紋捕鳥蛛粗毒中兩種最豐富的成分，HWTX-Ⅰ是一個雙功能活性分子既能抑制大鼠DRG神經元TTX-S鈉通道(IC50～57.40±1.42 nM)又能專一抑制N-型鈣通道(IC50～91 nM)，但是10μM HWTX-Ⅱ對大鼠DRG神經元細胞上鈉離子通道和鈣離子通道均無明顯作用。HWTX-Ⅱ和HWTX-Ⅰ混合后共同作用于TTX-S鈉通道與N-型鈣通道其活性分別增加10倍和6倍。進一步研究表