乳腺癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選及鑒定.pdf

1、背景：
　　乳腺癌目前已成為全球女性最常見的惡性腫瘤之一，全球平均每年130萬(wàn)人新患乳腺癌，每年約40萬(wàn)人死于該病，其發(fā)病率和死亡率在女性腫瘤中位居第二.乳腺癌現(xiàn)已位居我國(guó)女性惡性腫瘤的發(fā)病率的首位。乳腺癌的發(fā)病率隨著年齡的增加而升高，絕經(jīng)后的女性患病率增加。然而，有15％~25%被確診乳腺癌的女性尚未絕經(jīng)，大約有7%為年齡在40歲以下的育齡期女性。乳腺癌對(duì)患者的身心健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，它的預(yù)后與多因素相關(guān)，如病理組織學(xué)分

2、型、臨床分期、是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)嚴(yán)重縮短了乳腺癌患者的術(shù)后生存時(shí)間。目前癌癥死亡率高的主要原因就是缺乏用于高危人群篩查和早期診斷的具有高敏感性和特異性的生物指標(biāo)，如能對(duì)處于亞臨床階段的乳腺癌做到早期發(fā)現(xiàn)，將有助于早期應(yīng)用有效干涉手段阻止或逆轉(zhuǎn)乳腺癌的發(fā)展，從而大大改善乳腺癌患者的預(yù)后。雖然血清生物標(biāo)記分子在乳腺癌的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)中尚無(wú)很大作用，但是從體液中分析得到的一組有效生物標(biāo)記分子相比其他臨床和病理診斷方法對(duì)于疾

3、病的早期診斷或許更有價(jià)值且能最大限度降低創(chuàng)傷。因此尋找能用于早期診斷、準(zhǔn)確預(yù)后判斷以及預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的新的蛋白標(biāo)志物對(duì)于提高乳腺癌診斷和治療效果具有重要意義。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)能夠聯(lián)系并且反映癌癥基因的改變以及細(xì)胞生理學(xué)變化，因此人們現(xiàn)在逐漸寄希望于利用蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)找尋腫瘤蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物。蓬勃發(fā)展的蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)，使得高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為可能，也為乳腺癌新的血清生物標(biāo)記分子的發(fā)現(xiàn)提供了更有前景的平臺(tái)。SELDI-TOF-

4、MS蛋白芯片技術(shù)通過比較腫瘤組織和正常組織、或腫瘤患者體液與正常人體液之間的蛋白質(zhì)譜變化，找出具有差異性的蛋白質(zhì)，即腫瘤相關(guān)蛋白。多數(shù)研究者認(rèn)為，如能根據(jù)蛋白質(zhì)組的變化來(lái)預(yù)測(cè)和診斷疾病，那么其準(zhǔn)確性將大大提高。檢測(cè)疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)變化比基因檢測(cè)和當(dāng)前一些常規(guī)檢測(cè)更加準(zhǔn)確有效。
　　本課題利用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，以乳腺癌患者和健康女性的血清標(biāo)本為研究對(duì)象，研究乳腺癌術(shù)前組與正常對(duì)照組、

5、術(shù)后組和復(fù)發(fā)組之間，以及三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間血清蛋白質(zhì)譜變化特征，以尋找相關(guān)血清蛋白標(biāo)記分子，為乳腺癌的早期診斷、療效評(píng)價(jià)及不同分子類型預(yù)后分析提供一定幫助。
　　目的：
　　應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)乳腺癌術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)發(fā)組與正常對(duì)照組血清之間以及三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組血清之間的蛋白質(zhì)譜，篩選出各組之間具有差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，確定某些能夠反映腫瘤存在、療效評(píng)價(jià)以及惡性程度最高的分子

6、分型與其他分子分型之間預(yù)后情況的血清生物學(xué)指標(biāo)。建立更為完善的早期診斷、療效評(píng)估以及預(yù)后分析的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。
　　材料與方法：
　　材料:
　　收集自2010年01月至2014年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院尚未進(jìn)行任何治療的女性乳腺癌患者資料60例，年齡22~69歲，平均44.6+0.3歲，均接受手術(shù)治療，術(shù)后病理均證實(shí)為乳腺癌。術(shù)后按治療原則接受放療或化療，但不列入本次實(shí)驗(yàn)考慮因素。60例患者中三陰性乳腺癌患者

7、有22例，術(shù)后有11例復(fù)發(fā)，其中復(fù)發(fā)患者中有8例為三陰性乳腺癌患者。另收集住院就診的非乳腺疾病的育齡女性的血清樣本20例設(shè)為正常對(duì)照。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均已詳細(xì)告知參與實(shí)驗(yàn)的患者，且已征得其知情同意。收集所有乳腺癌術(shù)前、對(duì)應(yīng)術(shù)后2周及術(shù)后復(fù)發(fā)患者的血清標(biāo)本，各為60例、60例、11例。均在清晨05:00～06:00取血，要求患者在空腹?fàn)顟B(tài)下，使用紅頭干燥管，于室溫靜置0.5h~1h，離心機(jī)離心15~30min，3000 r/min,抽取上清液，標(biāo)

8、記好信息后于1h內(nèi)置于-80℃冰箱。
　　方法:
　　1）.對(duì)乳腺癌血清樣本的處理:將預(yù)先準(zhǔn)備好的血清標(biāo)本放置入冰盒內(nèi)解凍，溶解后離心3~5min取上清，將點(diǎn)過樣的96孔蛋白芯片裝入bioprocessor，并做好詳細(xì)記錄，等待檢測(cè)。2）.調(diào)置 SELDI-TOF-MS系統(tǒng):利用已知 WCX2蛋白質(zhì)芯片對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校正，保證分子量誤差不超過0.1%，并對(duì)質(zhì)譜儀參數(shù)、最佳激光強(qiáng)度及最佳靈敏度等進(jìn)行設(shè)定，最高分子量設(shè)為30000D

9、a，最佳范圍設(shè)為2000Da~20000Da。收集初步篩選結(jié)果，并通過特定軟件進(jìn)行分析處理，得到各個(gè)樣本中的m/z峰，通常認(rèn)為差異＜0.3%的考慮為同一類。得到初步篩選結(jié)果之后，再對(duì)不同組間的m/z峰值數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腫瘤組與正常組以及腫瘤組不同分型之間得到具有差異性的蛋白峰值，尋找近似值，范圍+0.3%。3）.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離純化血清樣本：將處理后的血清樣

10、本進(jìn)行凝膠電泳分離，在對(duì)應(yīng)的分子量軸上切取膠片，進(jìn)行標(biāo)記后分裝到不同 EP管中，按照膠內(nèi)酶解試劑說(shuō)明書上的操作步驟，分別進(jìn)行洗滌、脫色和干燥處理后，加胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。4）目標(biāo)蛋白質(zhì)的鑒定：加入提取液，10000r/min離心10-15min后提取上清液，進(jìn)行點(diǎn)樣，放入MALDI-TOF/TOF進(jìn)行激光轟擊，收集到相應(yīng)的肽段，最后通過Mascot搜索軟件，和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行連接、比對(duì)以及匹配，最終得到目標(biāo)蛋白

11、質(zhì)。
　　結(jié)果:
　　1、正常組、乳腺癌術(shù)前組、術(shù)后組及復(fù)發(fā)組間的比較結(jié)果
　　正常組、乳腺癌術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)發(fā)組的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過基線減除、去噪、標(biāo)準(zhǔn)化處理和聚類分析后得到各自的峰值，經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，共得到4個(gè)具有差異性的蛋白峰值（P<0.01）。其中有3個(gè)在乳腺癌術(shù)前組高表達(dá)，質(zhì)荷比（M/Z)分別為6683.8 Da、4695.0 Da、和3983.8 Da，差異＜0.3%的考慮為同一類，它們?cè)谛g(shù)后組

12、蛋白峰值降低，復(fù)發(fā)組中又出現(xiàn)峰值的升高；1個(gè)在術(shù)前組呈低表達(dá)，質(zhì)荷比（M/Z)為1553.1 Da，術(shù)后組表達(dá)量升高，復(fù)發(fā)組表達(dá)量又復(fù)下降。通過SVM回歸，篩選出youden指數(shù)最高的模型，最終得到m/z峰位于6683.8 Da的蛋白標(biāo)記物。在正常組低表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為118.6+37.5，在術(shù)前組高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為898.9+55.9，術(shù)后組表達(dá)量下降，表達(dá)強(qiáng)度為194.7+44.1，在術(shù)后復(fù)發(fā)組又呈高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度474.2+83.2

13、。非乳腺癌組與術(shù)前組、術(shù)前組與術(shù)后組、術(shù)后組與復(fù)發(fā)組比較差值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），非乳腺癌組與術(shù)后組、術(shù)前組與復(fù)發(fā)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。
　　2、三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組的比較結(jié)果
　　采用SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)對(duì)三陰性乳腺組與非三陰性乳腺癌組進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到具有差異性的蛋白質(zhì)峰值（P<0.01），共篩選出8個(gè)，其中有4個(gè)在三陰性乳腺癌組高表達(dá)，質(zhì)荷比（M/Z)分別為668

14、3.3 Da、4295.0 Da、1699.3 Da和1070.8 Da，表達(dá)強(qiáng)度分別為805.4+65.7、732.0+137.7、336.1+90.9、566.3+41.1。通過SVM篩選出youden指數(shù)最高的模型，得到m/z峰位于6683.8 Da的蛋白標(biāo)記物，其在非三陰性乳腺癌中表達(dá)強(qiáng)度206.3+29.0，其表達(dá)在三陰性乳腺癌組和非三陰性乳腺癌組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＝0.001637<0.01）。
　　3、目標(biāo)

15、蛋白質(zhì)的鑒定
　　對(duì)乳腺癌血清標(biāo)本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化和酶解后，將所得肽段復(fù)合物放入 MALDI-TOF/TOF進(jìn)行激光轟擊，最終確定目標(biāo)蛋白質(zhì)。質(zhì)荷比m/z6683.8 Da的蛋白質(zhì)最終被鑒定為apoC-Ⅲ(載脂蛋白C-Ⅲ）。
　　結(jié)論：
　　1.質(zhì)荷比（M/Z）為6683.8 Da的蛋白質(zhì)或肽段經(jīng)過鑒定為apoC-Ⅲ(載脂蛋白C-Ⅲ），可作為乳腺癌的蛋白標(biāo)記物。
　　2.質(zhì)荷比（M/Z）為6683.8