乳腺癌病人組織和血液中microRNA的表達(dá)：一種潛在的乳腺癌篩選標(biāo)記.pdf

1、早期乳腺癌患者通常缺乏明顯的臨床體征，而且目前臨床上尚無(wú)有效的早期輔助診斷方法，多數(shù)病例在確診時(shí)已是中晚期，治療效果不佳，預(yù)后較差。因此尋找乳腺癌的前期發(fā)病標(biāo)志，對(duì)于乳腺癌的早期診治及實(shí)施一級(jí)預(yù)防具有重大意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明microRNA(miRNA)能夠作為癌癥的生物學(xué)標(biāo)志。而在血液中檢出癌癥特異性的miRNA并將其作為癌癥的生物學(xué)標(biāo)志對(duì)于早期診斷癌癥則具有至關(guān)重要的意義。目前獲得miRNA表達(dá)譜的方法有小RNA克隆、N

2、orthern印跡、芯片技術(shù)、定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)及深測(cè)序研究方法，其中測(cè)序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。所以本論文采用ABI公司的SOLiD測(cè)序儀對(duì)乳腺癌病人腫瘤組織和血清miRNA譜進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的miRNA。本論文分為三部分：
　　

3、第一部分
　　首先，分別建立腫瘤組織和血清miRNA表達(dá)譜：收集未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性乳腺癌組織及癌旁組織各5例；收集未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性乳腺癌病人血液13份，年齡匹配健康人血液10份。獲得下列miRNA表達(dá)譜：(1)乳腺癌組織；(2)癌旁組織；(3)乳腺癌病人血清；(4)對(duì)照血清。建立兩套不同的miRNA表達(dá)譜：乳腺癌組織vs.癌旁組織，乳腺癌血清vs.對(duì)照血清，進(jìn)行比較。我們找出在腫瘤組織和血清均上調(diào)表達(dá)的miRNA進(jìn)一步篩

4、選和驗(yàn)證。
　　經(jīng)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNA(miR-103，miR-23a，miR-29a，miR-222，miR-23b，miR-24andmiR-25)在乳腺腫瘤組織和乳腺癌病人血清中都發(fā)生上調(diào)改變。
　　同時(shí)挖掘測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一新的miRNA：miR-BS1。
　　第二部分
　　對(duì)候選miRNA進(jìn)行兩輪篩選，首先在小樣本中(20份未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性乳腺癌病人腫瘤組織和癌旁組織)，檢

5、測(cè)7個(gè)miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-222在乳腺腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。然后再在大樣本中(未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性乳腺癌病人(50例)、乳腺良性腫瘤病人(乳腺纖維瘤、乳腺囊性增生病、乳腺大導(dǎo)管乳頭狀瘤、脂肪瘤，20例)，卵巢癌病人(20例)和正常對(duì)照(50例)血清)驗(yàn)證其靈敏度和特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-222在乳腺癌病人血清中表達(dá)高于健康對(duì)照組，P=0.0032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線(Rceiveroperativ

6、echaracteristic，ROC)分析顯示血清miR-222可以區(qū)分乳腺腫瘤病人和健康人(曲線下面積為0.6712，95％CI=0.5649to0.7775)。以0.006為截?cái)帱c(diǎn)(cut-offpoint)(相對(duì)于RUN6B的表達(dá))，其靈敏度為74％，特異度為60％。腫瘤樣本中miR-222>0.006的OR值(oddsratio)為4.269(95％CI=1.828to9.971)。而且miR-222在乳腺腫瘤病人，健康對(duì)照，

7、乳腺良性腫瘤病人和卵巢癌病人血清中表達(dá)有明顯差異(P=0.006)，提示miR-222可能是潛在的乳腺腫瘤篩選標(biāo)志物。
　　第三部分
　　針對(duì)前期測(cè)序結(jié)果利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一新型miRNA，命名為miR-BS1，從二級(jí)結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)保守性，表達(dá)，生物功能，靶基因預(yù)測(cè)分析等方面綜合驗(yàn)證其真實(shí)性。1)miR-BS1前體二級(jí)結(jié)構(gòu)符合莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)是處在具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA分子中遠(yuǎn)離環(huán)或膨脹部分的一端。2)在GenBank中搜索不

8、同物種miR-BS1序列發(fā)現(xiàn)在小鼠(Musmusculus)，果蠅(Drosophilagrimshawi)，大鼠(Rattusnorvegicus)，非洲爪蛙(Xenopuslaevis)，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)，棕狒狒(Papioanubis)和大西洋鮭(Salmosalar)中各有一條miR-BS1序列，將不同物種miR-BS1成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)為第5位到第11位以及第13位到第17位堿

9、基為保守堿基，說(shuō)明miR-BS1基因在不同物種間的高度保守性。將miR-BS1“2-8”種子序列與已知發(fā)現(xiàn)的hsa-miR比對(duì)發(fā)現(xiàn)，miR-BS1與miR-3675-3p具有相同的種子序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-BS1與hsa-miR-20b-3p(ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG)，和hsa-miR-455-3p“8-15”堿基匹配(GCAGUCCAUGGGCAUAUACA)。3)采用NorthernBlot方法證明miR-BS

10、1在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中均有表達(dá)，然后Real-TimePCR測(cè)定miR-BS1在乳腺腫瘤組織和乳腺腫瘤病人血清中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-BS1在腫瘤組織和腫瘤病人血清中表達(dá)均下調(diào)。4)采用miR-BS1特異模擬物直接轉(zhuǎn)染至MCF-7和MDA-MB-23l細(xì)胞48h后，使用改良的MTT方法測(cè)定細(xì)胞活性，初步觀察到miR-BS1對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用。我們將進(jìn)一步確認(rèn)miR-BS1對(duì)細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞生