Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞差異表達的miRNA對凋亡及軸突的影響.pdf

1、目的:篩選Aβ25-35誘導人源SH-SY5Y細胞損傷時差異性表達顯著的miRNA，并探討目標miRNA對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞凋亡及軸突的影響。
　　方法:
　　1.基因芯片篩選并驗證參與Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞損傷的miRNA:將細胞分成正常組和AD模型組。模型組加入Aβ25-35(40μmol/L)，正常組加入對應(yīng)量生理鹽水，培養(yǎng)48 h后，提取細胞RNA。經(jīng)Agilent RNA6000 N

2、ano/Pico Assay法檢測各組所提RNA質(zhì)量合格后，使用HmiOA7.1基因芯片進行miRNA基因芯片雜交程序。使用芯片熒光掃描儀掃描基因芯片熒光信號并轉(zhuǎn)換成影像數(shù)據(jù)，分析對比模型組與正常組的miRNA表達數(shù)據(jù)得出顯著變化的miRNA。根據(jù)miRNA的豐度以及變化程度，在上調(diào)和下調(diào)列表中分別選出差異表達明顯的3個miRNA，并對其進行QPCR驗證。
　　2.Hsa-miR-4487及hsa-miR-6845-3p靶基因GO

3、生物學過程富集分析以及KEGG信號通路分析:使用DAVID網(wǎng)站對miRwalk中多個數(shù)據(jù)庫(TargetScan，miRDB，miRWalk，miRanda)預測的hsa-miR-4487或hsa-miR-6845-3p靶基因交集進行GO分析以及KEGG通路分析，得出受Aβ25-35調(diào)控的兩種miRNAs各自參與的生物信息學過程和通路。
　　3.Hsa-miR-4487、hsa-miR-6845-3p分別對Aβ25-35所致SH-

4、SY5Y細胞凋亡及軸突的影響:SH-SY5Y細胞分成正常組（mimics/inhibitor control），對照組(hsa-miR-4487 mimics/hsa-miR-6845-3p inhibitor)，模型組(Aβ25-35+mimics/inhibitor control)，干擾組(Aβ25-35+hsa-miR-4487 mimics/hsa-miR-6845-3pinhibitor)。轉(zhuǎn)染mimics或inhibito

5、r9小時后，模型組和干擾組加入Aβ25-35共培養(yǎng)48h，采用流式細胞儀檢測hsa-miR-4487對細胞凋亡的影響以及激光共聚焦檢測hsa-miR-6845-3p對Aβ25-35誘導細胞軸突損傷的影響。
　　結(jié)果:
　　1.參與Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞損傷的miRNA:MTT法檢測Aβ25-35對SH-SY5Y細胞活力的影響。結(jié)果顯示20μmol/L組細胞存活率與正常組相比顯著降低，給予40μmol/L Aβ2

6、5-35處理后細胞存活力下降至51.6％±7(P＜0.01)。將各組所提的合格RNA進行miRNA基因芯片雜交程序，依據(jù)log2|Fold Change|≥0.585且P＜0.05的篩選條件，在人源SH-SY5Y細胞株中用對應(yīng)的2588種成熟的miRNA探針得出顯著上調(diào)的基因為155種，顯著下調(diào)的基因數(shù)為50。選取變化明顯的6種miRNA進行Real-time PCR驗證，結(jié)果顯示6種miRNA表達變化趨勢與基因芯片結(jié)果具有一致性。其中

7、給予Aβ25-35處理后下調(diào)最明顯且具有統(tǒng)計學意義的是miR-4487，而顯著性上調(diào)最明顯為miR-6845-3p。
　　2.Hsa-miR-4487及hsa-miR-6845-3p靶基因生物學過程通路富集分析:根據(jù)miRwalk和DAVID的預測顯示hsa-miR-4487多數(shù)靶基因參與了凋亡信號通路，而hsa-miR-6845-3p則參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，細胞粘附、增值，細胞大小調(diào)節(jié)，樹突棘生長，軸突導向，長時程增強等。

8、　　3.Hsa-miR-4487、hsa-miR-6845-3p分別對Aβ25-35所致SH-SY5Y細胞凋亡及軸突的影響:100nM hsa-miR-4487mimics濃度轉(zhuǎn)染細胞，用流式細胞儀檢測正常組，對照組，模型組，hsa-miR-4487mimics轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常情況下，只轉(zhuǎn)染hsa-miR-4487mimics組與轉(zhuǎn)染mimics control組細胞凋亡率都處于較低水平，而提前轉(zhuǎn)染hsa-miR-448

9、7mimics，再給予Aβ25-35，細胞凋亡率從模型組的54.74％顯著下降至21.11％(P＜0.05)。構(gòu)建hsa-miR-6845-3p inhibitor，激光共聚焦檢測正常組、對照組、模型組、轉(zhuǎn)染組細胞軸突長度以及SH-SY5Y細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)在正常細胞中轉(zhuǎn)入hsa-miR-6845-3p inhibitor后與對照組相比，突起長度有所增加，給予Aβ25-35損傷后，細胞突起減少變短，轉(zhuǎn)染hsa-miR-6845-3p inhi