葛根素對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中p53及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞凋亡過程中p53及其相關(guān)基因的變化，并探討葛根素的保護(hù)作用。
　　方法：用含13％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞。按實驗設(shè)計將細(xì)胞分為6組：對照組；MPP+模型組；50μmol/L葛根素+MPP+處理組；100μmol/L葛根素+MPP+處理組；150μmol/L葛根素+MPP+處理組；p53抑制

2、劑（Pifithrin-ɑ）+MPP+處理組。采用倒置顯微鏡觀察各組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；噻唑藍(lán)（MTT）法測定各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率；Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析術(shù)檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率；免疫印跡法（Western blotting）檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞中p53蛋白的相對表達(dá)量；實時熒光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription-PCR，

3、RT-PCR）技術(shù)分析各組SH-SY5Y細(xì)胞中p53及其相關(guān)基因p21、MDM2、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量。
　　結(jié)果：1.形態(tài)學(xué)改變，對照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)較長較多；MPP+模型組細(xì)胞大部分突起結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少；葛根素預(yù)處理組和p53抑制劑（Pifithrin-ɑ）組，細(xì)胞形態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。2 MTT結(jié)果顯示對照組，MPP+模型組，50μmol/L葛根素+MPP+處理組，

4、100μmol/L葛根素+MPP+處理組，150μmol/L葛根素+MPP+處理組，Pifithrin-ɑ+MPP+處理組的細(xì)胞存活率分別為100.0%±0.0%、36.0%±0.5%、52.0%±3.0%、76.6%±4.8%、86.0%±2.0%、92.0%±2.0%，葛根素和p53抑制劑預(yù)處理可以明顯提高細(xì)胞存活率（P<0.05）。3 Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析術(shù)檢測結(jié)果顯示對照組，MPP+模型組，50μmol/L葛根素

5、+MPP+處理組，100μmol/L葛根素+MPP+處理組，150μmol/L葛根素+MPP+處理組，Pifithrin-ɑ+MPP+處理組的細(xì)胞凋亡率分別為12.01%±3.31%、31.78%±1.50%、25.34%±1.06%、21.70%±3.2%、16.28%±0.90%、14.23%±2.43%，表明葛根素可以降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率（P<0.05）；同樣，p53抑制劑也可以降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY

6、5Y細(xì)胞的凋亡率（P<0.05）。4 Western blotting檢測p53蛋白的表達(dá)結(jié)果表明MPP+使p53蛋白的表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而葛根素和p53抑制劑干預(yù)又使p53蛋白的表達(dá)降低。對照組，MPP+模型組，50μmol/L葛根素+MPP+處理組，100μmol/L葛根素+MPP+處理組，150μmol/L葛根素+MPP+處理組，Pifithrin-ɑ+MPP+處理組的p53蛋白相對表達(dá)量分別為0.12

7、±0.01、0.84±0.03、0.72±0.02、0.51±0.03、0.32±0.02、0.21±0.02。5 RT-PCR結(jié)果表明MPP+誘導(dǎo)可以增加p53 mRNA表達(dá)；葛根素預(yù)處理下調(diào)了p53基因及其相關(guān)基因p21、Bax、Caspase-3的mRNA的表達(dá)，上調(diào)了p53基因的負(fù)調(diào)節(jié)因子MDM2和凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA的表達(dá)。給予p53基因抑制劑干預(yù)后，p53基因及其相關(guān)基因p21、Bax、Caspase-3、MDM

8、2、Bcl-2的mRNA的表達(dá)變化與給予葛根素干預(yù)后的結(jié)果呈現(xiàn)出較為相似的結(jié)果。對照組，MPP+模型組，50μmol/L葛根素+MPP+處理組，100μmol/L葛根素+MPP+處理組，150μmol/L葛根素+MPP+處理組，Pifithrin-ɑ+MPP+處理組的細(xì)胞中p53基因的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.79±0.08、1.66±0.03、1.35±0.10、1.19±0.04、1.10±0.02；p21基因的相對表

9、達(dá)量分別為1.00±0.00、1.91±0.04、1.80±0.02、1.67±0.07、1.43±0.12、1.24±0.07；MDM2基因的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.62±0.11、0.88±0.08、1.27±0.18、1.50±0.18、1.69±0.36；Bax基因的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.53±0.14、1.90±0.39、1.61±0.32、1.16±0.43、1.03±0.12；Bcl-2基

10、因的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.18±0.06、0.74±0.07、2.19±0.16、2.30±0.30、2.47±0.20；Caspase-3基因的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.54±0.09、1.29±0.11、1.09±0.06、1.04±0.18、1.01±0.11。
　　結(jié)論： MPP+誘導(dǎo)可以導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中p53的激活轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)一系列相關(guān)靶基因的活化從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說明p53在SH-