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文檔簡介
1、目的
本實驗以“補元”思想理論為指導,從“治未病”理念出發(fā),分別從細胞因子含量變化、關(guān)節(jié)形態(tài)學改變、軟骨細胞增殖與凋亡四個方面、不同角度與層次研究補元要藥人參的有效成分人參皂苷 Rg1對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用,為中醫(yī)藥防治骨性關(guān)節(jié)炎提供科學的實驗研究依據(jù)。
方法
50只健康普通級新西蘭雄性大白兔,分成正常組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高劑量組,每組10只。除正常組外,其余4組兔采用左后肢管型石膏伸
2、直位固定法制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。從造模第2天開始進行藥物干預。人參皂苷 Rg1低、中、高劑量組分別給予人參皂苷 Rg15mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃給藥,正常組及模型組予以等劑量生理鹽水(5mL/kg)灌胃,每周3次,共6周。
1.炎性細胞因子檢測:各組分別于造模前及干預結(jié)束后,在嚴格無菌操作條件下行左膝關(guān)節(jié)穿刺,注入生理鹽水1ml、反復抽吸多次使沖洗液混勻后抽取關(guān)節(jié)液,測定干預前后關(guān)節(jié)液中重要致炎因子白細
3、胞介素1(IL-1)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化。
2.細胞形態(tài)學觀察:干預結(jié)束后在麻醉下用空氣栓塞法處死所有實驗兔,分別從大體肉眼觀、光鏡及透射電鏡(TEM)等方面,觀察各組兔膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學改變及超微結(jié)構(gòu)變化,并對觀察結(jié)果進行Mankin評分。
3.軟骨細胞增殖實驗:取負重面關(guān)節(jié)軟骨,采用RT-PCR技術(shù)檢測軟骨細胞增殖周期關(guān)鍵調(diào)控因子Cyclin D1、P21 mRNA表達情況;W
4、estern-blot技術(shù)檢測Cyclin D1、P21蛋白表達情況;增殖細胞核抗原(PCNA)檢測及細胞增殖指數(shù)(PI)分析軟骨細胞增殖活性,以研究人參皂苷Rg1對軟骨細胞增殖的影響。
4.軟骨細胞凋亡實驗:取負重面關(guān)節(jié)軟骨,采用RT-PCR技術(shù)檢測細胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Caspase-3、Bax/bcl-2 mRNA表達情況;Western-blot技術(shù)檢測Caspase-3、Bax/bcl-2蛋白表達情況,原位末端標記法(
5、Tunel)觀察軟骨細胞凋亡率,以研究人參皂苷Rg1對軟骨細胞凋亡的影響。
結(jié)果
1.炎性細胞因子含量變化:干預前各組關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、IL-1、TNF-α含量無明顯差異(P>0.05),干預結(jié)束后模型組關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、IL-1、TNF-α含量較干預前顯著提高(P<0.01);人參皂苷Rg1低、中、高劑量組NO、IL-1、TNF-α含量明顯低于模型組,差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01),且人參皂苷Rg1中、高劑量組N
6、O、IL-1、TNF-α含量低于人參皂苷Rg1低劑量組(P<0.05或P<0.01)。人參皂苷Rg1中、高劑量組相比,NO、IL-1、TNF-α含量差別無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2.組織形態(tài)學變化:大體肉眼觀:正常組關(guān)節(jié)軟骨表面整齊光滑有彈性,無軟化及缺損;模型組關(guān)節(jié)軟骨呈灰黃色,磨損嚴重,彈性差,局部出現(xiàn)潰瘍,滑膜大量增生;人參皂苷Rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨呈黃色,關(guān)節(jié)表面略顯粗糙,無軟骨缺損,滑膜少量增生;人參皂苷R
7、g1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表面尚光滑,無軟骨缺損。光鏡觀察:正常組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,四層結(jié)構(gòu)清晰有序,潮線完整;模型組關(guān)節(jié)軟骨層變薄,軟骨細胞數(shù)量減少,形態(tài)發(fā)生改變,排列混亂,裂隙深達輻射層,潮線破壞,番紅O染色重度減弱;人參皂苷Rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次基本完整,局部有表淺裂隙,潮線尚完整,番紅O染色輕、中度減弱;人參皂苷Rg1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次完整,軟骨表面尚光滑,排列輕度紊亂,潮線完整,番紅 O染色輕度減弱。Mankin評分:
8、模型組評分最高,其余各組與模型組比較,差異有顯著性意義(P<0.01),人參皂苷Rg1中、高劑量組Mankin評分低于人參皂苷Rg1低劑量組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但中、高劑量組兩組間比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電鏡觀察:模型組軟骨細胞輪廓不清,外形不規(guī)則,細胞器腫脹甚至消失,核固縮,染色質(zhì)邊聚,甚至出現(xiàn)核分裂,凋亡小體形成;人參皂苷Rg1低劑量組軟骨細胞輕度萎縮,輪廓尚清晰,胞漿內(nèi)細胞器輕度腫脹,胞核完整,核膜稍
9、內(nèi)陷,染色質(zhì)分布輕度邊聚;人參皂苷Rg1中、高劑量組軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)接近于正常組。
3.軟骨細胞增殖實驗:人參皂苷Rg1低、中、高劑量組P21 mRNA及相應蛋白的表達均低于模型組(P<0.05或P<0.01),而CyclinD1 mRNA及相應蛋白的表達高于模型組(P<0.05或P<0.01),PCNA檢測顯示人參皂苷Rg1低、中、高劑量組軟骨細胞增殖率明顯高于模型組(P<0.01)。各項指標中以中劑量組效果最佳。
10、 4.軟骨細胞凋亡實驗:模型組Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯高于正常組(P<0.01)及人參皂苷Rg1低、中、高劑量組(P<0.05或P<0.01);模型組 Bcl-2 mRNA及蛋白表達明顯低于正常組(P<0.01)及人參皂苷 Rg1低、中、高劑量組(P<0.05或 P<0.01)。Tunel法檢測顯示,低、中、高劑量組凋亡率顯著低于模型組(P<0.01);中、高劑量組凋亡率無顯著差別(P>0.05),但低于低劑量
11、組(P<0.05或P<0.01)。各項指標中以中劑量組效果最佳。
結(jié)論
1.伸直位管型石膏固定法造模6周,可成功建立類似臨床所見的人類骨關(guān)節(jié)炎模型。
2.一定劑量人參皂苷Rg1可有效減少關(guān)節(jié)液中炎性細胞因子NO、IL-1、TNF-α的含量,減輕關(guān)節(jié)炎癥反應,改善關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境。
3.一定劑量人參皂苷Rg1可有效提高軟骨細胞G1期關(guān)鍵正向調(diào)節(jié)蛋白CyclinDl的表達,抑制負向調(diào)控因子 P21表達,推
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