脾虛證兒童sAA活性比值和甜味覺差異小鼠糖代謝研究.pdf

1、目的:
　　本文研究脾虛證兒童檸檬酸刺激前后sAA活性比值變化，以及AMY1拷貝數(shù)、sAA蛋白含量、N-糖基化和非糖基化sAA含量改變，旨在為脾虛證兒童采用酸刺激前后sAA活性比值作為臨床診斷參考指標提供科學依據(jù)，并探討sAA活性比值下降與AMY1表達及sAA的N-糖基化修飾是否有關聯(lián)。
　　本文選用甜味受體基因差異小鼠進行甜味覺刺激實驗，觀察小鼠機體糖代謝反應情況，初步探討從甜味覺受體角度研究脾虛證的可能性。
　　方

2、法:
　　1、本研究2013年3月至11月，以廣告形式從廣州市海珠區(qū)婦幼保健院和廣東藥學院校園分別募集47名健康兒童和52名健康成人，采集唾液標本后-80℃保存，并在一星期內以碘化鉀法提取基因組DNA。DNA提取后，DNA含量和純度測定以及體外PCR擴增驗證如上述;另外，為了探討唾液中微生物和食物殘渣是否會干擾PCR擴增，本研究還對碘化鉀法提取的基于因組DNA進行了TP53基因熒光實時定量PCR擴增。在上述收集的全部脾虛證和健康對

3、照兒童病例中，經(jīng)過測量身高(cm)和體重(kg)后，根據(jù)6個大型國際流行病學調查界定的標準，以體重指數(shù)將其分為低BMI和正常BMI兒童;另外，根據(jù)中國肥胖工作組設立的標準排除超重或肥胖兒童。
　　采取唾液及指標測定
　　唾液流率、pH值及總蛋白測定:唾液流率即為唾液體積與收集耗時的比值; pH精密試紙測定唾液pH值;BCA蛋白測定試劑盒測定唾液總蛋白含量(mg/mL)。
　　sAA活性測定:利用國際臨床化學和實驗室醫(yī)學

4、聯(lián)盟所推薦的EPS-G7速率法，來測定sAA活性(U/mL)。sAA比活(U/mg)=sAA活性(U/mL)/總蛋白含量(mg/mL)。
　　sAA含量測定:通過引進已知含量的人源sAA標準品，利用WB的方法測定檸檬酸刺激前后唾液樣品中糖基化、非糖基化及總sAA的含量(mg/mL)。sAA糖基化水平即糖基化sAA含量占總sAA含量的比例。
　　AMY1基因拷貝數(shù)測定:根據(jù)本實驗前述從唾液中提取基因組DNA方法學考察結果，利用

5、碘化鉀法提取兒童唾液基因組DNA后，對AMY1基因和腫瘤蛋白TP53基因進行熒光定量PCR擴增。
　　采用GraphPad Prism5.0進行作圖并統(tǒng)計學分析，計量資料以(X)±SD表示，刺激前后唾液指標組內比較進行配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，兩組數(shù)據(jù)相關性分析用Pearson相關系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.小鼠甜味覺差異與代謝及食欲等生理與行為學指標相關性研究
　　2.1 動物倫理

6、、模型及分組
　　小鼠是利用129P3/J(129)和C57BL/6ByJ(B6)小鼠雜交后產(chǎn)生F1代，接著F1雜合后代F2再與129回交超過10次培育而成。經(jīng)TaqMan的SNP基因座鑒定分析方法鑒定，該系小鼠含兩種基因型，分別是129/B6-Tas1r3雜合小鼠(簡寫:B6/129)和129/129-Tas1r3純合小鼠(簡寫:129/129)。以129/129純合小鼠為對照組，以含外源性基因的B6/129雜合小鼠為實驗組，兩

7、組小鼠數(shù)量在12只到29只不等。
　　2.2 糖耐量和胰島素耐量實驗
　　甜味覺差異會引起糖代謝的變化，本實驗可以考察兩組小鼠糖代謝情況。當小鼠2-mo大時，每只小鼠首先接受腹腔注射的糖耐量實驗，接著是灌胃注射糖耐量實驗，然后是胰島素耐量實驗，各實驗間隔一周左右以洗脫實驗間相互影響;當小鼠6-mo大時，進行同樣的實驗。
　　2.3 甜味覺差異可以引起食欲變化，本實驗可以分析兩組小鼠多個生理與行為學指標。分別在2-mo和

8、6-mo對小鼠進行核磁共振分析后約一周，利用LabMaster系統(tǒng)對小鼠的能量代謝、活動量、進食及飲水量等進行測量。實驗結束后，數(shù)據(jù)進行平均化處理，得到24小時的平均數(shù)據(jù)進行展示。
　　2.4 體重曲線和身體成分構成分析實驗
　　體重曲線:小鼠體重分別在2-mo、3-mo、4-mo、5-mo和6-mo時于上午10:00左右進行測量，精確到0.1g，實驗結束后繪制體重曲線。
　　利用LunarPIXImusⅡdensit

9、ometer的雙能X線吸收測量法對小鼠身體成分進行分析;解剖:對小鼠進行DEXA后，解剖脂肪組織和內臟器官并稱重。
　　2.5 統(tǒng)計分析
　　采用Statistica統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1.不同濃度和面積檸檬酸刺激對健康成人唾液分泌的影響
　　研究結果提示，0.2M/2×或0.4M/1×檸檬酸濾紙可以顯著增加成人唾液的分泌和sAA活性，且刺激后sAA活性比值明顯高于刺激時。
　　

10、2.不同保存條件和提取方法對從唾液中提取基因組DNA的影響
　　2.1 碘化鉀法與試劑盒法提取新鮮和室溫保存唾液DNA的比較
　　2.1.1 基因組DNA的得率和純度
　　研究結果提示，碘化鉀法對兩種不同保存條件下唾液DNA的得率比較穩(wěn)定，但可能也存在少量RNA和鹽離子、糖類物質的殘留。
　　2.1.2 基因組DNA電泳結果
　　結果提示碘化鉀法對提取兩種不同保存條件下唾液DNA的降解程度較輕。
　　

11、2.1.3 基因組DNA體外PCR擴增
　　兩種不同提取方法和保存條件下得到的DNA樣品對TP53(192bp)和PRB-3(1261bp)基因都有非常好的PCR擴增效果，PCR產(chǎn)物大小與預期一致。
　　2.2 碘化鉀法提取-80℃凍存唾液DNA考察
　　研究結果提示，相對于商業(yè)試劑盒法，碘化鉀法可以快速穩(wěn)定地從不同保存條件下的唾液中提取足量和高質量的DNA。
　　3.脾虛證兒童酸刺激前后唾液指標變化
　　

12、研究提示健康兒童唾液分泌對檸檬酸刺激反應良好。提示脾虛證兒童酸負荷下唾液分泌反應減弱。兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，提示AMY1基因拷貝數(shù)對脾虛證兒童sAA活性比值改變可能無影響。
　　4.消瘦兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標組間比較兩組兒童刺激前后sAA含量和活性均無顯著差異（P＞0.05）。結果提示AMY1基因拷貝數(shù)對消瘦兒童sAA活性比值改變可能無影響。
　　5.甜味覺差異對小鼠糖代謝及食欲等的影響。結果

13、提示含來源于B6的Tas1r3等位基因小鼠即B6/129雜合小鼠，甜味覺病理性過高。
　　5.1 B6/129和129/129小鼠糖代謝比較。結果表明腹腔注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對受損。灌胃注射后，結果表明灌胃注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對受損。相對129/129小鼠，含外源性基因的B6/129小鼠腹腔及灌胃注射糖耐量均受損，符合脾虛證糖耐量異常或受損的特征。
　　5.2 胰島素耐量實驗注射胰島素后并

14、未發(fā)現(xiàn)顯著的基因型效應，結果提示兩組小鼠對胰島素敏感性相似。
　　5.3 基因型效應對小鼠進食量的影響接近顯著，結果提示，B6/129小鼠進食和飲水量顯著降低，進一步推測其更符合脾虛證特征。2-mo時，posthoc顯示雄性129/129小鼠在11:00、12:00、13:00、14:00和15:00五個時間點的RER均顯著高于雄性B6/129小鼠(P＜0.05);6-mo時，雌性129/129小鼠在00:00、03:00和04:

15、00三個時間點的RER均顯著高于雌性B6/129小鼠(P＜0.05)，并且，雄性129/129小鼠在14:00和15:00兩個時間點的RER也顯著高于雄性B6/129小鼠(P＜0.05)?？梢姡鄬τ?29/129小鼠，B6/129的RER顯著降低。
　　基因型效應對小鼠的EE有顯著的影響，結果提示，B6/129的RER及EE顯著降低，能量代謝可能異常，符合脾虛證特征?；蛐托獙π∈蠡顒恿康挠绊懯秋@著的(P＜0.05)，相對于1

16、29/129小鼠，B6/129小鼠平均活動量更大。
　　5.4 B6/129和129/129小鼠體重曲線和身體成分構成比較。
　　5.4.1 體重曲線
　　本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠體重增長有明顯差異。
　　5.4.2 身體成分構成分析
　　核磁共振(NMR)分析:相對129/129小鼠，B6/129小鼠脂肪含量可能更高，但隨著時間推移下降相對明顯。
　　雙能X線吸收測量法(DEXA)分析:GLM分析并未

17、發(fā)現(xiàn)兩組小鼠各DEXA指標有明顯差異，但B6/129小鼠的脂肪含量有高于129/129小鼠的趨勢。
　　解剖分析: 雖然兩組小鼠體重增長無顯著差異，但就脂肪含量來說，B6/129小鼠可能更高，特別是棕色脂肪含量，即B6/129小鼠脂代謝可能異常，亦符合脾虛證特征。
　　結論:
　　脾虛證兒童研究表明，患兒酸刺激后sAA活性比值下降，并伴有sAA糖基化水平異常升高，而AMY1基因拷貝數(shù)無顯著變化，結果提示酸刺激后sAA活

18、性比值測定可作為兒童脾虛證臨床診斷客觀參考指標之一，而sAA活性比值下降可能與其糖基化調控機制有關。消瘦兒童獲得與脾虛證兒童研究的類似結果，提示脾虛是兒童消瘦的發(fā)病機制之一，同時也說明消瘦作為脾虛證的證候診斷指標之一是有科學依據(jù)的。
　　小鼠實驗研究表明，Tas1r3同源異基因的B6/129小鼠甜味覺病理性過高，類似《內經(jīng)》“有病口甘者”，出現(xiàn)糖脂代謝異常、食欲下降及能量代謝紊亂等現(xiàn)象，提示B6/129小鼠有應用于作為類脾虛證小鼠