基于N糖基化探討脾氣虛證患者sAA活性改變的機(jī)制.pdf

1、研究目的:
　　初步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)聯(lián)性;通過對兩種不同系統(tǒng)疾?。詼\表性胃炎與重癥肌無力），脾氣虛證（虛證）、脾虛濕熱證（虛實夾雜）及肝胃不和證（實證）患者sAA活性、N-糖基化蛋白表達(dá)及N-糖鏈亞型構(gòu)成比的觀察，以健康志愿者為對照，在分子水平探討脾氣虛證患者sAA活性改變的機(jī)制，為祖國醫(yī)學(xué)“脾主涎”理論的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的MG

2、患者61例，其中脾氣虛證患者33例，脾虛濕熱證患者23例，脾腎虧虛5例（因例數(shù)較少，暫未分析其指標(biāo)）;慢性淺表性胃炎患者101例，其中脾氣虛證患者36例，脾虛濕熱證患者40例，肝胃不和證25例，同時選取健康志愿者36例。
　　2.研究方法
　　2.1 受試患者情況分析
　　建立MG及CSG各證型患者的臨床癥候表現(xiàn)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行頻次及逐步回歸分析，觀察不同中醫(yī)證型的癥候表現(xiàn)，作為癥候與sAA活性關(guān)聯(lián)性研究的基礎(chǔ)。
　

3、　2.2 唾液樣本采集
　　使用專用唾液采集管，以口內(nèi)轉(zhuǎn)動棉柱法采集唾液樣本。按住院部患者（MG患者）與門診患者（CSG患者）時間安排在不同的時間采集，MG患者于6:30～7:30am采集，CSG患者于9:00～10:30am采集，健康志愿者也分為這兩個時間段采集以確保可與患者組在同一時間段平行比較各指標(biāo)。采集的唾液樣本經(jīng)離心后取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.3 sAA活性檢測
　　采用Bernfeld方法檢測s

4、AA活性，同時計算sAA活性比值（酸負(fù)荷后sAA活性/酸負(fù)荷前sAA活性）。
　　2.4 初步分析sAA活性比值與臨床癥候之間的關(guān)聯(lián)性
　　通過逐步線性回歸分析法初步探討臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)聯(lián)性。
　　2.5 健康者及各證型患者sAA糖基化程度研究
　　采用western blot法，以人sAA生物標(biāo)準(zhǔn)品為參照，對比觀察健康者及各證型患者sAAN-糖蛋白表達(dá)，分析各證型患者sAAN-糖基化蛋白缺失情況

5、。
　　2.6 sAAN-糖鏈亞型構(gòu)成比分析
　　檢測健康者及MG與CSG各證型患者與刀豆凝集素(conA)及麥胚凝集素(WGA)結(jié)合前后的sAA活性，并按公式:與凝集素的結(jié)合率=[（結(jié)合前sAA活性-結(jié)合后sAA活性）/結(jié)合前sAA活性]×100％，計算sAA與conA及WGA的結(jié)合率;進(jìn)一步以conA與WGA進(jìn)行凝集素親和層析實驗，分析N-糖鏈中高甘露糖型、雜合型及復(fù)合型糖鏈的構(gòu)成比情況。
　　2.7 植物凝集素的

6、篩選
　　定制凝集素芯片，篩選出與健康組、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA結(jié)合區(qū)別較大的凝集素，并再次以lectin Blot法進(jìn)行驗證，為下一步深入研究sAAN糖鏈類型研究打下基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果：
　　1.受試者一般資料
　　CSG患者101例，年齡21-60歲，平均年齡40.1±12.1歲，男性44例，女性57例，其中脾氣虛證患者36例，脾虛濕熱證患者40例，肝胃不和證患者40例;MG患者61例，年齡20

7、-65歲，平均48.1±14.7歲;男性24例，女性37例，其中脾氣虛證患者33例，脾虛濕熱證患者23例，脾腎虧虛證患者5例（因脾腎虧虛證患者例數(shù)較少，故暫未分析其指標(biāo)）。健康志愿者36例，年齡20-35歲，平均年齡28.3±5.8歲。
　　2.CSG與MG各證型患者臨床癥候結(jié)果
　　CSG脾氣虛證患者以舌淡、脈浮細(xì)弱、唇色暗淡、呃逆、食后腹脹、身重困倦、噯氣、腸鳴音亢進(jìn)、脘腹疼痛、肢體倦怠、大便溏泄等癥出現(xiàn)頻率較高;脾虛濕

8、熱型患者以舌紅、脈沉濡數(shù)、唇色暗淡、胃脘脹滿、食后腹脹、身重困倦、噯氣、呃逆等癥多見;肝胃不和型主癥表現(xiàn)為:脈弦，舌淡，脘腹脹滿或疼痛、噯氣、情志抑郁等癥。其中脾氣虛證患者食后腹脹、呃逆、口泛清涎、舌淡、脈浮細(xì)弱等癥的出現(xiàn)顯著頻率高于脾虛濕熱證及肝胃不和證患者(P＜0.01)。
　　MG脾氣虛證患者多見脈浮細(xì)弱、舌淡、眼瞼下垂、表情呆板、四肢無力、眼球活動不靈活、多汗、面色晦暗、神疲懶言、食欲減退等癥;脾虛濕熱證患者多見脈沉濡弱、

9、多汗、咀嚼無力、表情呆板、四肢無力、面色晦暗、身重困倦、渴欲飲水等癥。脾氣虛證患者食欲減退、口泛清涎、舌淡、脈浮細(xì)弱、眼瞼下垂、眼球活動不靈活等癥的出現(xiàn)頻率顯著高于脾虛濕熱證(P＜0.01)，此結(jié)果可為進(jìn)一步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間關(guān)系的基礎(chǔ)。
　　3.sAA活性檢測結(jié)果
　　健康志愿者酸負(fù)荷后sAA活性升高，CSG、MG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者酸負(fù)荷后sAA活性下降，CSG肝胃不和組患者酸負(fù)荷后sAA活性升

10、高;CSG、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA活性比值（酸負(fù)荷后/酸負(fù)荷前）與健康組相比明顯降低(P＜0.05)，CSG肝胃不和組患者sAA活性比值與健康組相比無差異。提示脾虛病理狀態(tài)（包括脾虛濕熱）在酸負(fù)荷前sAA活性可代償性升高，而應(yīng)激力下降，導(dǎo)致在酸負(fù)荷后sAA活性的下降，sAA活性比值降低。
　　4.臨床癥狀與sAA活性比值的關(guān)聯(lián)性結(jié)果
　　通過逐步線性回歸分析發(fā)現(xiàn)CSG脾氣虛證患者sAA活性比值與食后腹脹、脘腹疼痛

11、、呃逆三個癥候關(guān)聯(lián)性較大，且均呈負(fù)相關(guān);MG脾氣虛證患者sAA活性比值與口泛清涎、食欲減退、眼瞼下垂三個癥候關(guān)聯(lián)性較大，且呈負(fù)相關(guān)。CSG、MG其它證型均未發(fā)現(xiàn)與sAA活性比值有明顯相關(guān)性的癥候。因此提示脾氣虛證患者的某些臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)系較其它證型更為密切。
　　5.sAAN-糖基化研究
　　5.1 sAAN-糖基化程度分析
　　56.7％(17/30)的MG脾氣虛患者與36.4％(8/22)的MG脾

12、虛濕熱患者出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達(dá)缺失，明顯高于健康組的11.1％(4/36)(P＜0.05)，25.0％(8/32)CSG脾氣虛證及31.7％(13/41)的CSG脾虛濕熱證出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達(dá)缺失，明顯高于健康組的11.1％(P＜0.05)，而CSG肝胃不和證患者sAA N-糖基化蛋白缺失比例為8.7％(2/23)，與健康者無差異，提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAAN-糖基化蛋白表達(dá)缺失是sAA活性改變的病理背景之一。<

13、br>　　5.2 sAAN-糖鏈亞型結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
　　5.2.1 各組sAA與conA及WGA結(jié)合率結(jié)果比較
　　sAA與conA及WGA結(jié)合率比較結(jié)果顯示，MG脾氣虛組、脾虛濕熱組與CSG脾氣虛組、脾虛濕熱組患者酸負(fù)荷前、后sAA與conA的結(jié)合率均明顯高于健康者組(P＜0.05)，提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA中高甘露糖型及雜合型（生物活性較弱）蛋白構(gòu)成比高于健康者組;MG脾氣虛組、脾虛濕熱組及CSG脾氣虛組、脾虛濕

14、熱組患者酸負(fù)荷前、后sAA與WGA結(jié)合率均低于健康組（P＜0.05），說明復(fù)合型糖鏈（生物活性較強(qiáng)）的構(gòu)成比低于健康組，CSG肝胃不和組患者sAA與conA及WGA的結(jié)合率與健康組相比均無明顯差異，說明實證患者sAA糖鏈結(jié)構(gòu)無明顯改變。
　　5.2.2 各組sAA與conA及WGA親和層析結(jié)果比較
　　MG、CSG脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA與conA親和層析結(jié)果分別顯示弱結(jié)合峰面積與強(qiáng)結(jié)合峰面積峰面積高于未結(jié)合峰面積峰面

15、積，說明脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA中高甘露糖及雜合型糖鏈構(gòu)成比大于復(fù)合型糖鏈。MG、CSG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者sAA與WGA親和層析結(jié)果顯示，脾氣虛組患者未結(jié)合峰面積高于結(jié)合峰面積，脾虛濕熱組患者結(jié)合峰面積高于未結(jié)合峰面積，說明脾氣虛組患者sAA中復(fù)合型糖鏈構(gòu)成比降低，脾虛濕熱證患者sAA中雜合型與復(fù)合型糖鏈構(gòu)成比升高。綜合sAA與conA層析結(jié)果可推測脾氣虛組患者sAA中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈構(gòu)成比較高，脾虛濕熱組患者s

16、AA中雜合型糖鏈構(gòu)成比較高。結(jié)果提示， N-糖鏈中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈含量升高、生物活性較強(qiáng)復(fù)合性糖鏈含量降低是sAA活性下降的因素之一。
　　6.其他植物凝集素的篩選
　　6.1 LectinTM凝集素芯片結(jié)果
　　與健康組相對照，發(fā)現(xiàn)番茄凝集素(LEL)、馬鈴薯凝集素(STL)與麥胚凝集素(WGA)3個凝集素在健康組、重癥肌無力脾氣虛證及脾虛濕熱證患者唾液樣本中具有一定的區(qū)分能力，其中WGA在3組樣本中表現(xiàn)

17、出較大的差異?？蛇M(jìn)選用這三種凝集素進(jìn)行下一步的深入研究。
　　6.2 凝集素芯片驗證結(jié)果
　　通過Lectin blot實驗發(fā)現(xiàn)脾虛濕熱證患者sAA與WGA、LEL、STL結(jié)合的糖蛋白表達(dá)均高于健康者，比較三種凝集素結(jié)合糖鏈特異性可推斷本組MG脾虛濕熱證患者sAA中含有GlcNAc糖鏈結(jié)構(gòu)增多。提示W(wǎng)GA、LEL、STL所結(jié)合的糖蛋白在健康者與MG脾虛濕熱者之間有明顯的區(qū)分能力，可用于進(jìn)一步深入研究sAA糖鏈結(jié)構(gòu)類型。