FOXO1通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬降低氧化自由基對(duì)其細(xì)胞損傷的分子生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、本文通過研究FOXO1對(duì)于心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用，從而揭示FOXO1的功能是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷還是保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞，還是兩個(gè)兼有。同時(shí)進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞特異性缺失FOXO1促進(jìn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制和FOXO1過表達(dá)通過促進(jìn)細(xì)胞自噬降低細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究對(duì)于尋找抗心肌缺血再灌注損傷的藥物治療靶點(diǎn)，提高心肌梗死治療療效意義重大.
　　目的:
　　1.通過過氧化氫培養(yǎng)心肌細(xì)胞模擬過氧化自由基對(duì)心肌細(xì)胞損傷，檢測(cè)

2、過氧化氫對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，檢測(cè)FOXO1在蛋白、mRNA以及磷酸化水平的變化。以探討FOXO1對(duì)于心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。
　　2.利用轉(zhuǎn)染技術(shù)使FOXO1沉默，用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，檢測(cè)FOXO1mRNA的含量、細(xì)胞凋亡比例。在200uM過氧化氫培養(yǎng)后，用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，檢測(cè)caspase3含量、PARP含量、caspase3活性、自

3、噬囊泡的形成以及及LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值，以探討FOXO1與過氧化氫培養(yǎng)下心肌細(xì)胞凋亡和自噬的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞系處理方法:培養(yǎng)人類心肌細(xì)胞系H9c2，不同濃度過氧化氫培養(yǎng)細(xì)胞來模擬細(xì)胞受到氧化自由基損傷的模型，將培養(yǎng)好的H9c2細(xì)胞放置于0uM、50uM、100uM、200uM H2O2混合氣體中培養(yǎng)24到48小時(shí)。
　　2.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　H9c2心肌細(xì)胞用

4、0uM和200uM過氧化氫分別培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，細(xì)胞凋亡的結(jié)果用凋亡細(xì)胞比全部細(xì)胞進(jìn)行表示。
　　3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)caspase3和PARP蛋白以及caspase3活性表達(dá)。
　　0uM和200uM過氧化氫分別培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)，通過蛋白免疫印跡電泳法檢測(cè)caspase3和

5、PARP蛋白表達(dá)，通過熒光電泳法檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞的caspase3活性的表達(dá)，
　　4.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表達(dá)
　　0uM、50uM、100uM、200uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后，用蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)FOXOⅠ蛋白水平和FOXO1磷酸化表達(dá)。
　　5.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)FOXO1mRNA水平表達(dá)
　　0uM、50uM、100uM、2

6、00uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后，用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)FOXO1 mRNA水平表達(dá)。
　　6.用FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，使FOXO1沉默
　　通過轉(zhuǎn)染方法沉默F(xiàn)OXO1，用濃度為25nM、50nM的FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，未用FOXO1-specific siRNA只有脂質(zhì)體處理的作為對(duì)照組。
　　7.FOXO1-specific si

7、RNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后，檢測(cè)FOXO1mRNA水平表達(dá)
　　用25nM、50nM FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后，用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照組FOXO1 mRNA水平。
　　8.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　用25nM、50nMm FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)

8、染H9c2心肌細(xì)胞后，用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞組和空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡。
　　9.200uM過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞后，檢測(cè)caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表達(dá)。
　　200uM過氧化氫分別培養(yǎng)25nM、50nM FOXO1-spec

9、ific siRNA心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞后，通過熒光電泳法檢測(cè)caspase3活性的表達(dá)，通過蛋白免疫印跡電泳法檢測(cè)caspase3和PARP蛋白表達(dá)。
　　10.過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞自噬.
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間不同組別間差異比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后進(jìn)行兩兩比較，采用LSD進(jìn)行多重兩兩

10、比較，兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為0.05，當(dāng)P值小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞凋亡:
　　隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡增加。
　　2.3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)caspase3和PARP蛋白以及caspase3活性表達(dá)。
　　隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，caspase3和PAR

11、P蛋白以及caspase3活性表達(dá)增加。
　　3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞后檢測(cè)FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平和FOXO1磷酸化表達(dá)
　　用0uM、50uM、100uM、200 uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，F(xiàn)OXO1蛋白水平、FOXO1 mRNA水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　與以上規(guī)律相反，H9c2心肌細(xì)胞在用0uM、50uM、100uM、200uM濃度的過氧化氫培養(yǎng)下，隨著過氧化氫濃度的增高，

12、FOXO1的磷酸化水平逐步升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，磷酸化程度與過氧化氫濃度呈計(jì)量依賴性。
　　4.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞組和空白對(duì)照細(xì)胞組FOXO1mRNA的表達(dá)
　　FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組FOXO1mRNA的表達(dá)低于空白對(duì)照細(xì)胞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增大，F(xiàn)OXO1 mRNA的含量逐漸減小，

13、組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組細(xì)胞凋亡高于空白對(duì)照組間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增大，細(xì)胞凋亡升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.200uM過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRN

14、A轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞后，檢測(cè)caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表達(dá)。
　　200uM的過氧化氫培養(yǎng)下的FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度增高而增高，caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表達(dá)增高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

15、.05)。
　　7.過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞自噬
　　200 uM過氧化氫可以明顯誘導(dǎo)對(duì)照組細(xì)胞自噬囊泡的形成（綠色熒光蛋白陰性點(diǎn)），200 uM過氧化氫培養(yǎng)下，50nM FOXO1-specific siRNA細(xì)胞組自噬囊泡低于對(duì)照組（綠色熒光蛋白陰性點(diǎn)），200 uM過氧化氫培養(yǎng)下，50nMFOXO1-specific siRNA細(xì)胞組的GFP-LC3、L

16、C3Ⅱ/LC3Ⅰ低于對(duì)照組(P＜0.05)。即FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞組降低過氧化氫誘導(dǎo)自噬(p＜0.01).
　　結(jié)論：
　　1.過氧化氫損傷心肌細(xì)胞造模成功，并將心肌細(xì)胞FOXO1沉默（用FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞）。
　　2.隨著過氧化氫濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞凋亡、caspase3、PARP蛋白水平及caspase3活性升高，呈劑量依

17、賴性。提示過氧化氫誘導(dǎo)凋亡。
　　3.過氧化氫培養(yǎng)心肌細(xì)胞，F(xiàn)OXO1在蛋白和mRNA的水平未發(fā)生變化，隨著過氧化氫的濃度增高，F(xiàn)OXO1磷酸化水平升高，提示過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡可能是通過促FOXO1磷酸化，進(jìn)而抑制FOXO1對(duì)心肌細(xì)胞的修復(fù)作用。
　　4.在200uM過氧化氫培養(yǎng)后，隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度增高，細(xì)胞凋亡比例、caspase3含量、PARP含量以及caspase3活性增高。提