FoxO1對高糖誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病( diabetes nephropathy，DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥之一。目前，DN的發(fā)病復(fù)雜，其機(jī)制尚不完全清楚。既往認(rèn)為腎小球損傷是在糖尿病腎病發(fā)展為終末期腎?。‥SRD）過程中最重要的病理變化。然而，腎小管及腎間質(zhì)占全部腎臟體積的90％左右，腎小管細(xì)胞的損傷在DN發(fā)病過程中起著同樣重要作用。越來越多的證據(jù)表明，在腎小球?yàn)V過正常的時(shí)候，腎小管性蛋白尿已經(jīng)可以在尿液中檢測到，這就說明腎小管在D

2、N發(fā)病機(jī)制中獨(dú)立于腎小球的改變，腎小管細(xì)胞受損是DN早期的原始改變，阻斷腎小管近端上皮細(xì)胞受損更接近于治療靶點(diǎn)的源頭。
　　自噬(autophagy)是細(xì)胞通過溶酶體降解自身受損細(xì)胞器以及大分子物質(zhì)的過程，在腎臟疾病中起著重要的作用。自噬分為選擇性自噬和非選擇性自噬。其中，機(jī)體通過選擇性自噬清除各種細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等，分別稱為線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬等。正常情況下，細(xì)胞自噬功能處于一個(gè)正常的基礎(chǔ)

3、水平，來維持細(xì)胞正常的生理功能。若機(jī)體自噬出現(xiàn)異常，則可能會導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前，調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制不太清楚。
　　叉頭狀轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子O1(forkhead transcription factorsof the O class1)在抗氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄翻譯、糖脂代謝等方面具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可以調(diào)節(jié)線粒體自噬，減少ROS的過度釋放，進(jìn)而改善糖尿病足細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。腎小管細(xì)胞中的研

4、究發(fā)現(xiàn)，高糖會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞自噬功能的下降，可能與DN的發(fā)病機(jī)制可能有密切的關(guān)系。BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亞家族，研究發(fā)現(xiàn)BNIP3可以激活線粒體自噬，既往研究發(fā)現(xiàn)在急性腎損傷的腎近曲小管細(xì)胞中，F(xiàn)oxOs可以通過下游靶基因Bnip3抑制mTORC1的作用，開始自噬，促進(jìn)凋亡。由此我們推斷，F(xiàn)oxO1/Bnip3通路在糖尿病腎病的腎小管中也可能發(fā)揮重要作用。FoxO1可以通過上調(diào)Bnip3的表達(dá)，啟動(dòng)線粒

5、體自噬，減少損傷。
　　目的：
　　在前期研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)外最新研究成果，擬通過體內(nèi)和體外在高糖條件下，觀察調(diào)節(jié)FoxO1的表達(dá)對線粒體自噬和在近端腎小管損傷中的影響，并探究其是否通過激活下游BNIP3的表達(dá)發(fā)揮作用，為DN的防治提供新的思路。
　　方法：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，利用雄性C57BL/6野生小鼠和同型FoxO1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型。實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組，普通小鼠對照

6、組（NG）、轉(zhuǎn)基因小鼠正常組（TG）、普通糖尿病小鼠（DM）、轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠（TG-DM）。每組各8只。12周末小鼠心臟取血檢測血清肌酐、尿素氮；各組代謝籠收集24h尿檢測24h尿總蛋白、尿微量白蛋白；尾靜脈取血測血糖，小鼠麻醉后，迅速剝離出腎臟，其中放入4%戊二醛中固定用于電子顯微鏡的檢查，置于4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片，剩余放入凍存管于液氮中冷凍，Western blot檢測FoxO1表達(dá)水平及磷酸化狀態(tài)（p-FoxO1）、B

7、NIP3、LC3、P62的蛋白水平；免疫組化檢測FOXO1、BNIP3在各組大鼠腎組織中的表達(dá)。透射電鏡、HE染色、Massion染色觀察腎臟的病理學(xué)變化。
　　使用CRISPR/Cas9技術(shù)在腎小管上皮細(xì)胞上過表達(dá)/敲除FoxO1，使用BNIP3 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下：
　?、僬Ｌ菨舛冉M(NG，5.6mmol/L)；
　　②高糖（HG，25mmol/L)；
　?、鄹咛?FoxO1上

8、調(diào)組（HG+KI）；
　?、蹷nip3 siRNA轉(zhuǎn)染組（HG+KI＋Bnip3 siRNA）。
　　各組處理后實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各組FoxO1、BNIP3、LC3、P62 mRNA的表達(dá)水平。Western blot檢測FoxO1表達(dá)水平及磷酸化狀態(tài)（p-FoxO1）、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平；免疫熒光化學(xué)檢測各組細(xì)胞 FoxO1和 BNIP3的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測各組 ROS的生成率；檢

9、測各組細(xì)胞ATP的生產(chǎn)率。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠各組腎臟腎小管上皮細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)以及活性的改變，與NG組相比，DM組小鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞中 FoxO1蛋白水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,p-FoxO1/FoxO1蛋白水平增高（P<0.05），與DM組相比，TG-DM組FoxO1蛋白水平增高（P<0.05），p-FoxO1/ FoxO1水平降低（P<0.05）。表示高糖可以誘導(dǎo)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性下降,轉(zhuǎn)基因小

10、鼠FoxO1上調(diào)成功。
　　2.動(dòng)物驗(yàn)證 FoxO1對BNIP3通路的影響，與NG組相比，DM組 BNIP3蛋白水平降低，LC3、P62蛋白水平均明顯升高（P<0.05）,與DM組相比，TG-DM組BNIP3蛋白水平升高，LC3、P62蛋白水平均降低（P<0.05）。HE和掃描電鏡染色顯示TG-DM組腎小管結(jié)構(gòu)等病變均較 DM組有所減輕。
　　3.細(xì)胞各組FoxO1表達(dá)以及活性的改變:與NG組相比，HG組FoxO1 mRNA

11、及蛋白水平無明顯變化，p-FoxO1/FoxO1水平增高（P<0.05）。HG+KI組較HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平升高，p-FoxO1/FoxO1水平降低（P<0.05）。說明高糖可以誘導(dǎo) FoxO1轉(zhuǎn)錄活性下降，CRISPR/Cas9技術(shù)在腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)FoxO1成功。
　　4.細(xì)胞中FoxO1對BNIP3通路的影響:與NG組相比，HG組BNIP3 mRNA及蛋白水平降低，LC3、P62 mRNA及蛋白水平均升高

12、（P<0.05），與HG組相比，HG+KI組BNIP3 mRNA及蛋白水平升高，LC3、P62 mRNA及蛋白水平均有所降低（P<0.05）。轉(zhuǎn)染 BNIP3敲除的質(zhì)粒后，上調(diào)FoxO1對上述指標(biāo)的影響被阻斷。
　　5.與NG組相比，HG組明顯升高腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平（P<0.05），與HG組相比，HG+KI組可顯著抑制高糖的影響（ P<0.05），轉(zhuǎn)染BNIP3敲除的質(zhì)粒后，上調(diào)FoxO1對上述指標(biāo)的影響被阻斷。