阿霉素致心肌細胞氧自由基釋放的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、阿霉素(adriamycin,ADR)屬于蒽環(huán)類抗生素,是一種高效的廣譜抗腫瘤抗生素,臨床上廣泛用于治療乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤。但阿霉素在臨床化療中的毒性反應呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應線性關(guān)系,即隨著劑量的增加出現(xiàn)骨髓抑制、心臟毒性、脫發(fā)等毒副作用也愈加突出,尤其是嚴重的心臟毒性,可引起各種心律失常、充血性心力衰竭甚至死亡,因此大大限制了它的臨床使用。
   阿霉素引發(fā)心臟毒性的作用機制有多種學說,其中氧自由基學說被多數(shù)

2、研究者所認同。阿霉素的氧自由基學說認為,ADR進入心肌細胞后,在微粒體中由還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細胞色素P450還原酶提供一個電子轉(zhuǎn)變?yōu)閹б粋€多余電子的半醌ADR,該半醌ADR又把此電子傳遞給氧分子(O2),使O2變成超氧陰離子(·O2-);在線粒體中由還原型輔酶Ⅰ(NADH)及NADH-氧化還原酶提供一個電子轉(zhuǎn)變?yōu)榘膈獳DR,并與O2作用產(chǎn)生·O2-,同時伴有過氧化氫(H2O2)生成增加。·O2-與H2O2通過Haber-wei

3、ss反應或Fenton反應產(chǎn)生羥自由基(·OH)。這些在心肌細胞中產(chǎn)生的氧自由基(OFR,包括·O2-、OH、H2O2)作用于細胞膜及各種細胞器膜上的磷脂中的多價不飽和脂肪酸,形成脂質(zhì)自由基,引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應,使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、扭曲,并影響膜上功能蛋白質(zhì)的位置及構(gòu)型,最終導致膜的完整性遭到破壞,膜的流動性降低,通透性增加,容量調(diào)節(jié)功能及離子轉(zhuǎn)運功能障礙,嚴重影響細胞的功能,造成心肌細胞損傷。
   氧自由基造成的心臟損傷作用

4、近年來被作為基礎醫(yī)學和生命科學領(lǐng)域的研究熱點。目前,在活體細胞中可標記氧自由基并對其進行實時監(jiān)測定量的指示劑種類還比較缺乏,尋找一種特異性高、靈敏、可進行定量的氧自由基指示劑成為當前研究的一大重點。2008年,北京大學分子醫(yī)學研究所程和平教授研究組研究發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞超氧自由基生成事件,并命名為“超氧炫”(superoxide flashes),這是首次在活體細胞中觀測到局部、間歇性、量子化超氧的產(chǎn)生。超氧炫為線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔道(

5、mPTP)開放所觸發(fā),與線粒體電子傳遞鏈活性密切相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)是基于發(fā)明了一種新穎的高特異性超氧指示劑,即基因編碼的、定位于線粒體的可用于實時測量的熒光蛋白。
   本實驗擬就阿霉素導致心肌細胞早期損傷的氧自由基學說進行研究,采用上述這種新型高特異性超氧指示劑“超氧炫”熒光蛋白,研究線粒體上氧自由基釋放是否是阿霉素致心肌細胞損傷的早期事件,為阿霉素導致心肌細胞損傷的氧自由基學說提供直接證據(jù),同時,對藥物所致細胞線粒體上超氧陰離子

6、生成情況進行研究,為進一步利用此種高特異性超氧指示劑建立藥物致心肌細胞損傷評價方法打下基礎。
   1新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染
   目的:建立新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)方法,完成“超氧炫”腺病毒的擴增及轉(zhuǎn)染,為下一步實驗打下基礎。
   方法:(1)新生大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)取新生72小時內(nèi)的SD乳鼠,消毒,開胸,夾取心室部分,于冰浴的PBS液中洗滌,剪碎。消化6-8次后,過濾,離心,收集細胞,用培養(yǎng)液混懸,

7、差速貼壁80分鐘后,收集培養(yǎng)液中的非貼壁細胞,種于24孔板中,24小時后換培養(yǎng)基,然后每隔1天更換培養(yǎng)基1次。(2)“超氧炫”腺病毒的擴增培養(yǎng)293A細胞,當細胞密度達到70-80%時,換液,加入腺病毒液,48-72小時后,當有70-80%細胞變圓漂起時,收集病毒,-80℃/37℃反復凍融3次,離心,收集上清液。如此重復擴增3輪。第四輪擴增時,當有50%細胞變圓漂起時,收集病毒,離心,棄去上清液,用1ml培養(yǎng)基重懸細胞,-80℃/37℃

8、反復凍融3次,離心,收集上清液,分裝,-80℃儲存。(3)“超氧炫”腺病毒的滴度測定在6孔板中培養(yǎng)293A細胞,當各孔細胞密度達到70-80%時,換液,加入稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的腺病毒液,沒加病毒的一孔細胞作對照。72h后選取剛好全部細胞變圓漂起或僅有少量細胞貼壁但細胞形態(tài)也已回縮的一孔,認為此孔病毒的MOI值約為10。(4)“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞向新生大鼠心肌細胞和成年大鼠心肌細胞中分別加入適量

9、的腺病毒,培養(yǎng)48-72h后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
   結(jié)果:
   (1)心肌細胞形態(tài)學觀察24 h后觀察細胞已基本全部貼壁,貼壁后為梭形或菱形,有一部分細胞已開始搏動。繼而細胞逐漸在皿底表面鋪展,并伸出偽足,形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網(wǎng),在培養(yǎng)72 h后可形成呈放射狀排列的細胞簇,其搏動已同步化。
   (2)“超氧炫”腺病毒的滴度測定72 h后,對照孔的細胞已生長連接成片;10-1孔細

10、胞全部變圓漂起,懸浮在培養(yǎng)基中;10-2孔細胞絕大部分漂起,懸浮在培養(yǎng)基中,還有一小部分細胞貼壁,但細胞形態(tài)也已回縮;10-3孔和10-4孔細胞回縮變圓漂起、懸浮在培養(yǎng)基中的數(shù)量隨著加入病毒量的減少而減少,貼壁細胞隨之增加;10-5孔中幾乎沒有細胞懸浮在培養(yǎng)基中。故判定10-2孔病毒的MOI值約為10。
   (3)在激光共聚焦顯微鏡下觀察“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞的結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡下可看到“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞的

11、效率很高,90%以上的心肌細胞均已被腺病毒感染,并表達其所攜帶的熒光蛋白,產(chǎn)生黃色熒光。
   結(jié)論:本實驗成功改進了新生大鼠心肌細胞的培養(yǎng)方法及腺病毒的擴增、轉(zhuǎn)染方法,使心肌細胞的成活率高,腺病毒的擴增操作簡易、高效,為后續(xù)實驗打下了良好基礎。
   2阿霉素致心肌細胞氧自由基釋放的測定
   目的:以“超氧炫”熒光蛋白為指示劑,直接觀察阿霉素引起的心肌細胞氧自由基釋放情況。
   方法:(1)驗證“超

12、氧炫”熒光蛋白是否可作為心肌細胞線粒體上的超氧指示劑在激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察單個心肌細胞給蒼術(shù)苷(20μM)前后“超氧炫”熒光強度的變化。記錄細胞XYT平面內(nèi)給蒼術(shù)苷前后“超氧炫”熒光強度,并計算二者比值。(2)阿霉素致心肌細胞氧自由基釋放的測定在激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察單個心肌細胞給阿霉素(1.84μM)前后“超氧炫”熒光強度的變化。記錄細胞XYT平面內(nèi)給阿霉素前后不同時間點的“超氧炫”熒光強度,并分別計算給藥后不同時間點與給藥

13、前的熒光強度比值。
   結(jié)果:
   (1)驗證“超氧炫”熒光蛋白是否可作為心肌細胞線粒體上的超氧指示劑蒼術(shù)苷使心肌細胞給藥后300s的熒光強度平均增加到給藥前的111.08±3.63%(n=9),通過統(tǒng)計學分析可得,給藥后300s心肌細胞的“超氧炫”熒光強度比給藥前顯著增強(p<0.01)。由于蒼術(shù)苷是mPTP開放劑,可促使mPTP開放,線粒體跨膜電位降低,線粒體解聯(lián)的呼吸鏈產(chǎn)生大量活性氧,所以可以推斷“超氧炫”熒光

14、強度與心肌細胞線粒體上超氧陰離子的生成呈正相關(guān),進而驗證了“超氧炫”熒光蛋白確實是一種定位于線粒體上可用于實時監(jiān)測的高特異性超氧指示劑。
   (2)阿霉素致心肌細胞氧自由基釋放的測定心肌細胞在給阿霉素后120s、300s、600s、1200s、1800s分別使其“超氧炫”熒光強度平均增加到給藥前的112.00±2.99、120.32±1.48、123.50±3.41、134.05±4.19、140.21±1.82%(n=6),

15、通過統(tǒng)計學分析可得,給藥后120s心肌細胞的熒光強度就比給藥前顯著增強(p<0.01),隨著時間的延長,其熒光強度逐漸增強。由于“超氧炫”熒光強度與心肌細胞線粒體上超氧陰離子的生成呈正相關(guān),所以可以推斷在本實驗所用給藥濃度的阿霉素作用下,給藥后120s心肌細胞線粒體上超氧陰離子生成顯著增多(p<0.01)。由于所用的阿霉素的給藥濃度是公認的阿霉素造成急性心肌細胞中毒的濃度,所以可以認為在本實驗中給阿霉素后會引起心肌細胞急性損傷中毒,因此

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