基于病毒宏基因組學(xué)的病原體鑒定及分析.pdf

1、病毒以異養(yǎng)寄生的方式存在于近乎所有的生物中，有些病毒能對(duì)寄主造成危害甚至是死亡。傳統(tǒng)的病毒鑒定方法包括過濾篩選、組織培養(yǎng)、電子顯微鏡觀察、血清學(xué)、疫苗接種，以及細(xì)胞培養(yǎng)等，但這些方法都依賴對(duì)病毒的分離富集、病毒在蛋白和核酸水平上序列保守性等信息，往往對(duì)一些不易擴(kuò)增的病毒或者和已知病毒序列保守性很低的新病毒的鑒定就無能為力。病毒宏基因組學(xué)是一種新興的病毒組學(xué)研究技術(shù)，該方法不需要對(duì)病毒進(jìn)行培養(yǎng)，且在未知病毒序列的情況下，它可以直接以環(huán)境樣

2、本中所有病毒的遺傳物質(zhì)為研究對(duì)象，快速地鑒定出樣本中的所有病毒組成。目前基于宏基因組學(xué)來對(duì)病毒樣品進(jìn)行研究的方法很多，包括對(duì)small RNAs、total RNA/DNA、viral RNA/DNA等分析。本論文主要應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法，對(duì)具有病害癥狀的檳榔和煙草的植物樣本的小RNA進(jìn)行分析，鑒定獲得兩個(gè)新的長(zhǎng)線性病毒;通過對(duì)腹瀉嬰幼兒糞便樣品中病毒的富集和隨后的核酸分析，獲得了樣本中的病毒譜。
　　對(duì)具有黃化癥狀的檳榔樣本中

3、的小RNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序后獲得46，613，994條序列，組裝后生成11，246個(gè)contigs，經(jīng)blast比對(duì)篩選發(fā)現(xiàn)在26個(gè)與已知病毒具有部分同源性的序列中有21個(gè)與長(zhǎng)線形病毒具有部分同源性。選取LChV1作為參考序列，經(jīng)RT-PCR、5'-RACE-PCR、3'-RACE-PCR和Sanger-sequencing，最終發(fā)現(xiàn)了一種歸屬于Velarivirus屬的新病毒APV1，全長(zhǎng)16080 bp，具有11個(gè)ORFs，

4、其中ORF10是APV1所特有的，ORF1a和ORF4均具有兩段內(nèi)部重復(fù)序列，且ORF1a還具有兩段跨膜區(qū)，這些都是APV1有別于其它Velarivirus屬中病毒的特點(diǎn)所在。APV1的鑒定將為未來研究病毒與檳榔黃化病之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　在具有葉鑲嵌、萎縮和黃化等病害癥狀煙草中鑒定了一種歸屬與長(zhǎng)線形病毒的新病毒TV1-AH。全長(zhǎng)15，362 bp，含有185 bp的5'-UTR和330 bp的3'-UTR，以及9個(gè)O

5、RFs，包括病毒復(fù)制相關(guān)的ORF1，病毒組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ORFs2-6，作為RNA silencing repressor來發(fā)揮作用的ORF7，以及功能未知的ORF8。這些ORFs產(chǎn)物均與MV1產(chǎn)物具有最高同源性(49.74％，83.44％，58.73％，65.62％，56.52％，65.74％，49.48％，32.48％，40.88％)，此外還與其它長(zhǎng)線形病毒具有不同程度的相似性。TV1-AH是第一個(gè)在在煙草中被鑒定的長(zhǎng)線形病毒，它的

6、發(fā)現(xiàn)將為未來研究其與煙草病害之間的關(guān)系和病害防御起到重要作用。
　　對(duì)腹瀉嬰幼兒糞便樣品中的病毒顆粒進(jìn)行富集、抽提RNA來構(gòu)建文庫(kù)、Iontorrent測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)量篩選后獲得2，806，916條序列。經(jīng)聚類和組裝生成63，448條，宏基因組分類顯示與病毒相關(guān)的2，911條中有29條歸為輪狀病毒。針對(duì)這29條序列在所有序列中執(zhí)行blat，在找到49條與輪狀病毒有關(guān)序列中有29條都比對(duì)到了輪狀病毒A1上，以輪狀病毒A1作為參考基因組