共刺激分子B7-H4在人乳腺癌組織中的表達(dá)及在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是當(dāng)前女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)。三陰性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）是指雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptors-2，Her-2)均呈陰性的一種特殊類型乳腺

2、癌，占所有乳腺癌的10.0％～20.8％，是預(yù)后最差的一個(gè)亞型。它具有發(fā)病早、預(yù)后差、易早期復(fù)發(fā)、死亡率高、極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。共刺激分子B7同源體4（B7 homolog4，B7-H4）表達(dá)于多種惡性腫瘤，可抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。B7-H4表達(dá)水平與多種腫瘤患者的臨床病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)，可能成為腫瘤免疫治療的靶向分子。本研究通過探討B(tài)7-H4分子與TNBC臨床病理特征的

3、關(guān)系，以及對(duì)TNBC細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)特性的影響，分析B7-H4分子在TNBC發(fā)生及發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1、利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)B7-H4分子在Luminal A、Luminal B、Her-2和TNBC組織中蛋白水平的表達(dá)，并分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　2、構(gòu)建沉默B7-H4的 shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染TNBC細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-M

4、B-468，同時(shí)用control-shRNA做陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性方面的檢測(cè)。
　　3、利用熒光顯微鏡和Western-blot方法檢測(cè)control-shRNA和B7-H4-shRNA在MDA-MB-231，MDA-MB-453、MDA-MB-468細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，篩選一株細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　4、MTT法檢測(cè)下調(diào)B7-H4分子表達(dá)后對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞體外增殖的影響并繪制生長(zhǎng)曲線。<

5、br>　　5、利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下B7-H4分子表達(dá)后對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。
　　6、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)B7-H4分子表達(dá)后對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞凋亡情況。
　　7、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot方法檢測(cè)下調(diào)B7-H4分子表達(dá)后對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路中p65亞基mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組織化

6、學(xué)分析結(jié)果顯示
　　在111例乳腺癌組織中，B7-H4的陽(yáng)性率為73.9％(82/111)，主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿和胞膜。根據(jù)乳腺癌的分子表型進(jìn)行分類為:Luminal A型、Luminal B型、Her-2型和三陰型，結(jié)果顯示B7-H4在TNBC組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為90.2％(37/41)，明顯高于Luminal A型:66.7％(14/21)，Luminal B型:68.0％(17/25)和Her-2型:58.3％(14/24)

7、。B7-H4在TNBC組陽(yáng)性率明顯高于Luminal A型、Luminal B型、Her-2型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.0167)。
　　在41例TNBC組織中，B7-H4的高表達(dá)多見于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌型，與其他類型相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); B7-H4在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC患者組織中陽(yáng)性表達(dá)率比率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）;且B7-H4的表達(dá)與雄性激素受體(androgen receptor，AR)的陰

8、性表達(dá)顯著高于AR陽(yáng)性患者(P＜0.05)。研究未發(fā)現(xiàn)B7-H4的表達(dá)與TNBC患者其他臨床病理特征，如年齡、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67的表達(dá)存在相關(guān)性（P＞0.05）。
　　對(duì)TNBC組進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，B7-H4陽(yáng)性表達(dá)組5年無病生存率(disease free survival，DFS)為59.5％明顯低于陰性組75.0％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)結(jié)果
　　利用熒光

9、顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果，并用Western-blot方法檢測(cè)得到轉(zhuǎn)染效率分別為:①M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞:control-shRNA和B7-H4-shRNA的B7-H4與內(nèi)參灰度比值分別為0.236±0.180和0.180±0.018，B7-H4-shRNA轉(zhuǎn)染效率為23.6±0.03％(P＜0.01)。②MDA-MB-453細(xì)胞: control-shRNA和B7-H4-shRNA的B7-H4與內(nèi)參灰度比值分別為0.871±0.19

10、0和0.217±0.006，B7-H4-shRNA轉(zhuǎn)染效率為75.1±0.80％（P＜0.01）。③MDA-MB-468細(xì)胞:control-shRNA和B7-H4-shRNA的B7-H4與內(nèi)參灰度比值分別為0.691±0.018和0.358±0.061，B7-H4-shRNA轉(zhuǎn)染效率為48.2±8.00％。結(jié)果提示，MDA-MB-453細(xì)胞B7-H4蛋白高表達(dá)，且B7-H4-shRNA對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他兩

11、株細(xì)胞，（P＜0.01），因此適合進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)功能試驗(yàn)。
　　3、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果
　　MTT分析結(jié)果顯示，將control-shRNA組和B7-H4-shRNA組MDA-MB-453細(xì)胞分別接種于96孔板24h、48h、72h后，control-shRNA組細(xì)胞檢測(cè)的吸光度值分別為0.326±0.093，0.612±0.123，1.115±0.111;B7-H4-shRNA組細(xì)胞檢測(cè)的吸光度值分別為0.282±0.07

12、2，0.372±0.100，0.693±0.099。檢驗(yàn)結(jié)果分析，接種24h后，細(xì)胞增殖無明顯差異，而接種48h和72h后，B7-H4-shRNA比control-shRNA細(xì)胞增殖明顯降低，(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。B7-H4-shRNA在24h、48h、72h的增殖抑制率分別為12.8±4.1％、39.9±4.9％和38.0±2.8％。
　　4、細(xì)胞侵襲和遷移的檢測(cè)結(jié)果
　　倒置顯微鏡下觀察MDA-M

13、B-453細(xì)胞穿過Transwell小室侵襲至下室數(shù)量:control-shRNA組和B7-H4-shRNA組分別為(200.3±8.0)和（93.7±6.0）個(gè)/高倍視野(×100)，B7-H4-shRNA組明顯少于control-shRNA組（P＜0.01）;倒置顯微鏡下觀察MDA-MB-453細(xì)胞穿過Transwell小室遷移至下室數(shù)量:control-shRNA組和B7-H4-shRNA組分別為（295.0±8.7）和（147.

14、3±3.5）個(gè)/高倍視野(×100)，B7-H4-shRNA組明顯少于control-shRNA組（P＜0.01），結(jié)果說明下調(diào)B7-H4的表達(dá)可抑制MDA-MB-453細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染B7-H4-shRNA后，細(xì)胞凋亡率與control-shRNA組相比顯著增加，50.9±4.0％的MDA-MB-453細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P

15、＜0.05)。說明通過下調(diào)B7-H4可促進(jìn)TNBC細(xì)胞的凋亡，并調(diào)控細(xì)胞周期使其停滯于G0/G1期。
　　6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果
　　利用Real-time PCR方法檢測(cè)p65基因在MDA-MB-453細(xì)胞mRNA水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示B7-H4-shRNA組p65表達(dá)量明顯低于control-shRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而且Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示p65和

16、B7-H4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　利用Western-blot方法檢測(cè)p65分子在MDA-MB-453細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示B7-H4-shRNA組p65表達(dá)量明顯低于control-shRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且B7-H4與p65表達(dá)呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　B7-H4分子在不同乳腺癌亞型組織中均有表達(dá)，其中在TNBC中陽(yáng)性表達(dá)率最高。B7-H4的表達(dá)與TNBC病理類