植物抗病抗逆相關(guān)CN基因和ERFs基因的克隆及功能分析.pdf

1、病害、干旱、鹽堿等逆境脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，也是影響作物產(chǎn)量的主要脅迫因素，因此克隆抗病抗逆相關(guān)基因并利用這些基因改良作物的抗病抗逆性具有重要的意義。煙草不僅是一種模式作物，還是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草花葉病毒(TMV)是煙草中廣泛傳播的一種病毒，世界各煙區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，因此，篩選高抗TMV的煙草材料，并對(duì)其中的抗性基因進(jìn)行表達(dá)特性分析及功能鑒定具有重要意義。另一方面，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于

2、不同的植物物種中，如：擬南芥、番茄、煙草和水稻，參與調(diào)控干旱、高鹽、低溫、病害和細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控基因能夠調(diào)控多個(gè)下游功能基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得綜合抗病抗逆能力，克隆和轉(zhuǎn)化這些轉(zhuǎn)錄因子具有較高的應(yīng)用價(jià)值。 本文主要分兩部分對(duì)植物抗病抗逆基因進(jìn)行研究：1，利用同源基因克隆技術(shù)從高抗TMV的中國(guó)地方煙草種質(zhì)HZNH中克隆到一個(gè)抗病相關(guān)基因，對(duì)此基因進(jìn)行了表達(dá)特性分析及功能鑒定；2，利用生物信息學(xué)方法，

3、對(duì)TIGR大豆基因索引數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，從中獲得具有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性分析，從中選取在不同脅迫條件下，表達(dá)都較好的基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 具體內(nèi)容如下： 1，CN基因的克隆及基因結(jié)構(gòu)分析：利用同源基因擴(kuò)增技術(shù)從高抗TMV的中國(guó)地方煙草種質(zhì)HZNH中克隆到一個(gè)新的基因，命名為CN基因。CN基因的編碼區(qū)為3423bp，同N基因有93.63％的核苷酸序列一致性，其編碼蛋白屬于TIR/N

4、BS/LRR類。基因組CN基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子序列同N基因具有較高的序列一致性，但內(nèi)含子區(qū)在序列和長(zhǎng)度上明顯不同。 2，CN基因的表達(dá)特性分析及功能鑒定：CN基因的表達(dá)受TMV誘導(dǎo)并具有溫度敏感性，其表達(dá)時(shí)間先于PRlα基因的表達(dá)。選擇性剪切分析表明CN基因的內(nèi)含子3不存在選擇性剪切。組織特異性表達(dá)分析表明：CN基因在葉中表達(dá)量較高，在莖中表達(dá)量較低，在根中表達(dá)量最低。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將CN基因轉(zhuǎn)入感TM

5、V煙草K326，轉(zhuǎn)基因煙草在TMV接種后表現(xiàn)出超敏反應(yīng)和系統(tǒng)性超敏反應(yīng)。 3，大豆AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析：用AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的種子模型對(duì)TIGR大豆基因索引數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，從中獲得148個(gè)含AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的TC/EST序列，其中26個(gè)屬于AP2家族成員，2個(gè)屬于RAV家族成員，120個(gè)屬于ERF家族成員。在120個(gè)ERF家族成員中，有98個(gè)成員含有完整的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，將這98個(gè)大豆ERF家族

6、成員和擬南芥ERF家族成員的序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明ERF家族成員的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域在大豆和擬南芥中是非常保守的，用于擬南芥ERF家族成員的分類方法也可以用于大豆ERF家族成員的分類，根據(jù)Sakuma et al．(2002)的分類，可將大豆ERF家族分為兩個(gè)主要的亞家族，DREB亞家族和ERF亞家族。其中，DREB亞家族又可分為六個(gè)亞組A1-A6，ERF亞家族也可分為6個(gè)亞組B1-B6。大豆ERF家族成員在AP2/ER

7、F結(jié)構(gòu)域外除和擬南芥分享一些共有的保守基序外，還有一些特異的保守基序，這些特有的保守基序可能在大豆的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。 4，ERF亞家族成員的表達(dá)特性分析：從ERF亞家族的6個(gè)亞組中，選取10個(gè)unigenes進(jìn)行表達(dá)特性分析，RT-PCR結(jié)果表明大豆花葉病毒(SMV)作為生物脅迫可誘導(dǎo)其中7個(gè)unigenes的表達(dá)；干旱、低溫和高鹽作為非生物脅迫分別誘導(dǎo)10個(gè)、6個(gè)和10個(gè)unigenes的表達(dá)；SA、ET、JA和AB

8、A作為植物激素則能誘導(dǎo)所有10個(gè)unigenes的表達(dá)。 5，GmERF3基因和GmERF4基因的體外結(jié)合特異性分析：從10個(gè)已被分析了表達(dá)特性的unigene中，我們選取兩個(gè)在不同生物和非生物脅迫下，表達(dá)情況都較好的基因，分別命名為GmERF3和GmERF4，進(jìn)行進(jìn)一步的分析。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GmERF3和GmERF4蛋白在體外都能與GCC box和DRE/CRT元件結(jié)合，不能與突變GCC或DRE/CRT結(jié)合，表明這兩個(gè)

9、基因可能同時(shí)應(yīng)答生物與非生物脅迫，參與多種信號(hào)路徑。 6，GmERF3基因和GmERF4基因的亞細(xì)胞定位分析：通過(guò)基因槍法分別將含GmERF3基因和GmERF4基因的亞細(xì)胞定位重組載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24h后共聚焦顯微鏡下觀察，驗(yàn)證他們是否具有核定位功能。結(jié)果表明：GmERF3和GmERF4基因都能定位于細(xì)胞核，可通過(guò)自身的NLS進(jìn)入核內(nèi)行駛功能。 7，GmERF3基因的自激活驗(yàn)證：利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)GmERF

10、3蛋白可能的修飾位點(diǎn)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果把GmERF3基因分成四個(gè)區(qū)段，分別克隆到酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體(pGBKT7)上，通過(guò)酵母的自激活實(shí)驗(yàn)確定誘餌區(qū)段。實(shí)驗(yàn)表明GmERF3基因具有較強(qiáng)的自激活活性，所分四個(gè)區(qū)段不僅能在SD/-Trp/-His/-Ura/-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，甚至還能在SD/-Trp/-His/-Ura/-Ade/15mM3AT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 8，GmERF3和GmERF4基因的功能鑒定：通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的葉盤轉(zhuǎn)

11、化法，分別將GmERF3和GmERF4基因轉(zhuǎn)化模式植物煙草，并對(duì)后代進(jìn)行檢測(cè)。鑒定結(jié)果表明：GmERF3基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)非生物脅迫干旱和高鹽的耐受，但是并不對(duì)冷脅迫產(chǎn)生耐受；對(duì)于生物脅迫，轉(zhuǎn)GmERF3基因明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)細(xì)菌性病原菌青枯菌和真菌性病原菌赤星菌的抗性，對(duì)于病毒性病原菌TMV，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草相比接種葉片的壞死斑產(chǎn)生時(shí)間一致，且無(wú)壞死斑大小和數(shù)量的差異，但是轉(zhuǎn)基因植株頂部葉片的壞死時(shí)間明顯比野生型延遲。轉(zhuǎn)