植物抗逆基因：GbTPS與BnPrx的克隆和表達分析.pdf

1、植物在生長發(fā)育過程中會遇到各種逆境的脅迫，為了對抗這些脅迫，他們在進化過程中形成了相應的應激機制。有些機制是為了適應某種特定的脅迫，比如說鈉氫泵在耐鹽中所起的作用；而有些卻能夠?qū)Χ喾N脅迫具有適應性，如本研究中的磷酸海藻糖合成酶與過氧化物酶。這類抗逆基因的克隆對于我們了解植物的抗逆機制意義重大。此外，通過遺傳工程將這些基因?qū)氲街参锂斨?，一方面可以更詳細的了解其功能；另一方面也可以將它們應用于實踐當中，比如提高農(nóng)作物抗逆性。本文分別從古老

2、藥用裸子植物銀杏和非常重要的農(nóng)作物——油菜當中克隆出了磷酸海藻糖合成酶基因和過氧化物酶基因并進行了各方面的分析與功能驗證，這兩種植物對于逆境都具有相當好的抗性。 1)銀杏磷酸海藻糖合成酶 在許多生物體中，海藻糖作為一種保護性的代謝產(chǎn)物，在植物對抗外界不良環(huán)境(如低溫、干旱、營養(yǎng)匱乏、高溫脫水及高鹽)的過程中起到了重要作用。本文主要介紹了從高度耐干旱及嚴寒的“活化石”銀杏中分離鑒定了一種編碼海藻糖-6-磷酸合成酶同源基因的

3、一段cDNA(GbTPS,GenBankAccessionNumberAY884150)。GbTPS編碼～段長868個氨基酸的多肽鏈，其等電點為5．83，分子量為97．9kD。氨基酸序列分析顯示，GbTPS與第二類海藻糖合成酶具有很高的相似性(和AtTPS7具有67％的相似性)。但僅分別僅與大腸桿菌中的OstA及釀酒酵母中的ScTPSl具有17％和23％的相似性?；蚪M序列分析表明它含有兩個內(nèi)含子。另外，該基因的啟動子序列也通過基因組步

4、移的方法克隆出來。DNA凝膠印跡分析顯示，GbTPS是～個小的多基因家族成員。RT-PCR的結(jié)果表明GbTPS在銀杏中的表達有組織特異性，在不同的發(fā)育時問表達情況也存在著差異表明該基因可能跟發(fā)育有關。同時，在一系列的環(huán)境脅迫(如嚴寒，高鹽，干旱及甘露醇較多)情況下，GbTPS也是誘導表達的。通過酵母互補實驗發(fā)現(xiàn)該基因不能使突變體tpsl和tps2恢復正常表型，可能具有其他的功能。為了更好的了解它的功能，分別將它的啟動子和開放閱讀框(op

5、enreadingframe，ORF)構(gòu)建到植物表達載體上轉(zhuǎn)化煙草，做功能研究。 2)油菜過氧化物酶 利用RACE的方法，從油菜當中克隆到一個新的過氧化物酶基因，BnPrx(GenBank登錄號：DQ078754)。該基因的cDNA全長為1307個堿基，包含有一個1062個堿基的ORF。這個ORF編碼了一個354個氨基酸的過氧化物酶前體，其中N．端的31個氨基酸為信號肽，C．末端的15個氨基酸為前導肽。這個推測出來的蛋白

6、分子量大小為38．86kDa，預測的等電點為5．85。BnPRX與HRPC具有相當高的同源性(89％)，而且它具有HRPC中出現(xiàn)的所有的活性位點。這些活性位點包括有：兩個Ca2+結(jié)合位點，6個糖基化位點。此外，軟件分析預測出來的BnPrx蛋白的三級結(jié)構(gòu)也跟HPRC的非常的相似。通過基因組步移的方法，我們得到了BnPrx的基因組序列，當中含有3個內(nèi)含子和4個外顯子。在啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了32個TATA盒、l8個CAAT盒還有其他很多的順式元件

7、比如說傷誘導元件(WUN)，甲基茉莉酸誘導元件(MejRE)。Southern雜交結(jié)果表明BnPrx屬于一個小的基因家族。通過PCR的方法構(gòu)建了一系列的啟動子序列缺失載體，構(gòu)建到pCAMBIAl304載體上，通過農(nóng)桿菌工程菌株EHAl05轉(zhuǎn)化煙草，對它的啟動子功能進行了分析。雜交分析顯示BnPrx在根、莖和葉當中都是一個組成性表達，在莖與葉當中表達量非常高。BnPrx也能夠被甲基茉莉酸、水楊酸、低溫和過氧化氫有誘導表達。對于BnPrx的