B10對(1,3)-β-D-葡聚糖所致肺部炎癥Th免疫應(yīng)答調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的:
　　在工農(nóng)業(yè)操作環(huán)境中存在的有機粉塵種類復(fù)雜，包括動植物本身具有的各種成分，而且經(jīng)常夾雜一些包括真菌、細菌在內(nèi)的微生物源性的多重致病性物質(zhì)，其中高濃度真菌污染較為常見。吸入被真菌、細菌或者動物蛋白等污染的有機粉塵而引起的以肺組織間質(zhì)細胞浸潤和肉芽腫形成為基本病理改變特征的疾病，稱為職業(yè)性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎。真菌細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分中包含(1，3)-β-D-葡聚糖，是公認的職業(yè)環(huán)境中真菌暴露的生物標(biāo)志物。
　　我們前期的

2、研究結(jié)果表明，由于(1，3)-β-D-Glucan暴露引起的變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎模型中，存在下列免疫應(yīng)答進程:(1)輔助性T細胞免疫應(yīng)答參與(1，3)-β-D-Glucan暴露引起的小鼠變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎的進展過程，其免疫應(yīng)答的效應(yīng)進程依賴于Th1-Th2的有序轉(zhuǎn)化，即Th1型免疫應(yīng)答向Th2型免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)平衡轉(zhuǎn)換;(2)Th1/Th2型免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)換和效應(yīng)強度可影響變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎的病理結(jié)局。
　　B10細胞作為調(diào)節(jié)性B細胞(Bre

3、g)的一類功能性亞群，主要通過分泌IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-10可以抑制巨噬細胞和樹突狀細胞活化及分泌促炎細胞因子，抑制CD4+T細胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α，進而抑制Th1和Th17細胞分化。與嵌合野生型小鼠相比，IL-10-/-小鼠所患關(guān)節(jié)炎更嚴重，Treg數(shù)量及Foxp3表達明顯降低，Th1和Th17細胞水平顯著提高。這進一步證實，IL-10可能協(xié)同其它的免疫細胞及Treg，抑制CD4+T淋巴細胞向Th1和Th17

4、方向分化發(fā)育，進而發(fā)揮負性免疫調(diào)節(jié)作用。
　　我們擬利用(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥模型，通過建立B10消除小鼠，研究B10對(1，3)-β-D-Glucan所致肺部炎癥特征及病理過程動態(tài)發(fā)展的影響，分析B10對肺部炎癥免疫應(yīng)答的調(diào)控作用機制。旨在為職業(yè)性免疫性肺疾病的預(yù)防和控制提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　一、實驗動物與分組
　　C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，按體重隨機分為4組

5、:B10消除葡聚糖組、葡聚糖組、B10消除生理鹽水組、生理鹽水組。B10消除組小鼠腹腔注射抗CD22單克隆抗體，以消除小鼠體內(nèi)B10。葡聚糖組小鼠非暴露氣管灌注葡聚糖，建立肺部炎癥模型。生理鹽水組小鼠灌注等體積生理鹽水。
　　二、H&E染色觀察(1，3)-β-D-Glucan所致肺部炎癥病理過程及特征
　　病理切片H&E染色動態(tài)觀察(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥病理過程及特征。
　　三、采用Giemsa染

6、色方法對BALF中細胞進行染色、計數(shù)
　　采用Giemsa染色方法對BALF中細胞進行染色，分別計數(shù)BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞。
　　四、流式細胞術(shù)檢測Th1/Th17/Treg/B10型細胞水平
　　取肺門淋巴結(jié)和脾細胞懸液，先進行表面染色，破膜，再進行細胞內(nèi)染色，檢測Th1/Th17/Treg/B10型細胞數(shù)量。
　　五、Realtime-PCR檢測Th1/Th17/Th2/Treg型

7、細胞因子的基因表達水平
　　Realtime-PCR檢測肺組織細胞因子IFN-γ、IL-13、IL-23、IL-10、CTLA-4和特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγt、GATA3和Foxp3 mRNA的表達水平。
　　六、統(tǒng)計學(xué)分析
　　全部數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，用SNK法進行組間比較。
　　結(jié)果:
　　一、B10細胞參

8、與(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥病理過程
　　葡聚糖灌入后各個時間點，B10消除葡聚糖組小鼠淋巴結(jié)組織和脾組織中，B10細胞數(shù)量都低于葡聚糖組，并且在第1天和第21天都顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、B10細胞消除加重(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥
　　與葡聚糖組相比，B10消除葡聚糖組小鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)目早期階段升高，而淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)目在中晚期階段升高。

9、r>　　H&E染色結(jié)果顯示，與葡聚糖組小鼠相比，B10消除葡聚糖組小鼠炎癥較重并且持續(xù)時間長。
　　三、B10細胞對(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥的調(diào)節(jié)效應(yīng)與Th免疫應(yīng)答相關(guān)
　　B10消除葡聚糖組的Th1型細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和細胞因子IFN-γ在各個時間點都高于葡聚糖組。與葡聚糖組相比，B10消除葡聚糖組小鼠Th2型細胞因子IL-13和Th2型細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達顯著升高。與葡聚糖組小

10、鼠相比，B10消除葡聚糖組小鼠Th1細胞數(shù)量在第1天和7天升高，21天后又顯著下降。
　　與葡聚糖組小鼠比較，B10消除葡聚糖組小鼠Th17細胞數(shù)量在第7天有所升高，而1、21天無明顯變化。在Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達也出現(xiàn)類似結(jié)果。
　　四、B10細胞通過影響Treg細胞調(diào)節(jié)Th免疫應(yīng)答
　　PCR結(jié)果顯示，小鼠灌入葡聚糖后能顯著增加肺組織IL-10、Foxp3及CTLA-4的表達，而B10細胞消除

11、后，肺組織IL-10、Foxp3及CTLA-4的表達顯著下降。與葡聚糖組比較，B10消除葡聚糖組淋巴結(jié)CD4+Foxp3+T細胞數(shù)量顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1、B10消除加重(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥。
　　2、B10細胞可抑制Th1/Th17/Th2免疫應(yīng)答，發(fā)揮對(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥的調(diào)控作用。
　　3、B10細胞可通過影響Treg調(diào)控Th免疫應(yīng)答，進而抑