酵母培養(yǎng)制備(1→3)-β-D-葡聚糖方法及相關(guān)基礎(chǔ)研究.pdf

1、具有免疫活性的(1→3)-β-D-葡聚糖是葡萄糖通過(guò)(1→3)-β-D-糖苷鍵連接而成的一類高分子化合物,廣泛分布在細(xì)菌、酵母、蘑菇、真菌、谷物、海藻中.Saccharomyces cerviseae是重要的一類單細(xì)胞真菌,外被一堅(jiān)硬的剛性細(xì)胞壁包圍,(1→3)-β-D-葡聚糖是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要組分之一.(1→3)-β-D-葡聚糖通過(guò)與巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞上的受體相互作用,誘導(dǎo)生物活性,提高宿主免疫功能,具有抗腫瘤和輻射保護(hù)

2、作用,是哺乳動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫促進(jìn)物,還可用于治療細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)引發(fā)的疾病.S.cerevisiae FL1因具有較厚的細(xì)胞壁而被選擇為(1→3)-β-D-葡聚糖的生產(chǎn)菌株.在液體YEPD培養(yǎng)基的生長(zhǎng),S.cerevisiae FL1最大比生長(zhǎng)速率μ<,max>0.51h<'-1>,細(xì)胞倍增時(shí)間約1.34h.在利用單因素?fù)u瓶實(shí)驗(yàn)考察營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件對(duì)S.cerevisiae FL1生物量影響的基礎(chǔ)上,得到了較優(yōu)的培養(yǎng)條件:8

3、％(w/v)葡萄糖,4％(w/v)蛋白胨,1％(w/v)酵母浸提物,培養(yǎng)溫度30℃,種齡5~8h,接種量2~4％(v/v),搖床轉(zhuǎn)速220r/min,裝液量30％(v/v).隨后,考慮到單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的局限性,采用了響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化.響應(yīng)面法系數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)的結(jié)合,它有助于快速建模、縮短優(yōu)化時(shí)間和提高工程應(yīng)用可信度.該工作提出了使用次氯酸鈉氧化S.cerevisiae FL1自溶細(xì)胞制備(1→3)-β-D-葡聚糖的思路.在考

4、察了各種理化因素對(duì)細(xì)胞自溶率的影響后發(fā)現(xiàn),52℃下,S. cerevisiae FL1暴露在1.5％(v/v)乙酸乙酯(pH5.5)溶液中,S.cerevisiae FL1自溶率達(dá)到最值.自溶36h后,自溶進(jìn)行得比較徹底.而且與平衡期的S.cerevisiae FL1細(xì)胞壁相比較,自溶細(xì)胞的細(xì)胞壁基本保持不變.利用自溶過(guò)程降解、去除細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì),繼而使用稀次氯酸鈉溶液氧化S.cerevisiae FL1自溶細(xì)胞制備真菌(1→3)-

5、β-D-葡聚糖.該研究考察了超聲波解聚和正丙醇硫酸酯作介質(zhì)的非均相磺化反應(yīng)對(duì)(1→3)-β-D-葡聚糖水溶性的影響.600W功率下超聲2.5h后,水溶性β-葡聚糖的收率為45.5％(w/w),超聲波解聚使多糖變得疏松,紅外吸收光譜揭示,超聲波處理并不影響β-葡聚糖的連接方式.使用正丙醇硫酸酯非均相體系可以制備(1→3)-β-D-葡聚糖硫酸酯,產(chǎn)品呈白色,完全溶于水,得率約為37.4％(w/w).葡聚糖硫酸酯元素組成(％,w/w)為:36

6、.260 C,6.105 H,51.115 O,5.782 S,0.738 N,經(jīng)驗(yàn)式為(C<,6>H<,10>O<,5>)<,25>·9SO<,3>·7H<,2>O,葡聚糖硫酸酯的磺化度為0.36,每100個(gè)葡萄糖殘基帶有36個(gè)磺酸基團(tuán).紅外譜圖、<'1>H NMR分析支持產(chǎn)物是(1→3)-β-D-葡聚糖硫酸酯.超聲波解聚和非均相磺化反應(yīng)都可以使多糖變得疏松,使雜質(zhì)容易從(1→3)-β-D-葡聚糖的構(gòu)成的空間網(wǎng)格中釋放出來(lái),有助于提高