膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸中的表達(dá)、定位及其與受精的關(guān)系.pdf

1、膜聯(lián)蛋白是一類鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，形成進(jìn)化上保守的多基因家族，在動(dòng)、植物中廣泛表達(dá)。在細(xì)胞各種生理功能中起重要作用。膜聯(lián)蛋白A1(AnnexinA1，簡(jiǎn)稱AnxA1)是哺乳動(dòng)物膜聯(lián)蛋白家族中的一個(gè)重要成員，它與細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳遞、炎癥等密切相關(guān)，前期研究已發(fā)現(xiàn)它在精子中亦有表達(dá)，并呈區(qū)域性分布，推測(cè)與精子的一系列鈣依賴事件如運(yùn)動(dòng)、頂體反應(yīng)過程中的膜融合、受精過程中的精卵相互作用等有關(guān)。但目前它在生殖系統(tǒng)中的作用尚不明確，在睪丸中

2、的表達(dá)定位尚未見報(bào)道，對(duì)其在精子中的定位研究還相當(dāng)有限，且還未見關(guān)于它在精子中功能的較為直接的研究。本文以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究AnxA1在出生后不同發(fā)育時(shí)期睪丸中的表達(dá)與定位，以期了解它與睪丸出生后發(fā)育及精子發(fā)生的關(guān)系；同時(shí)，對(duì)處于不同成熟階段及不同生理功能狀態(tài)的精子進(jìn)行AnxA1定位。此外，制備了AnxA1多克隆抗體并探討AnxA1與體外受精的關(guān)系。本研究旨在為闡明AnxA1在生殖系統(tǒng)中的作用奠定一定的基礎(chǔ)，可望為哺乳動(dòng)物及人類受精機(jī)

3、制的研究提供一定的理論依據(jù)，從而為輔助生殖技術(shù)、不育癥診療與計(jì)劃生育提供一定的理論指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)分三部分。 1.膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)與定位 對(duì)1～8周齡小鼠睪丸進(jìn)行AnxA1間接免疫組化染色及半定量RT-PCR以研究AnxA1的表達(dá)水平及其定位。結(jié)果顯示：AnxA1在各級(jí)生精細(xì)胞中均有表達(dá)。其中精原細(xì)胞染色最強(qiáng)，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)；初級(jí)精母細(xì)胞多為弱陽性或陰性；圓形精子細(xì)胞AnxA1分布在細(xì)胞一側(cè)頂

4、體泡、頂體帽中，精子的AnxA1分布在頂體中。精子形成后留下的殘余體亦呈強(qiáng)陽性染色。支持細(xì)胞未見明顯陽性染色。對(duì)1、2、3、4、5、6、8周齡小鼠睪丸AnxA1免疫組化染色陽性強(qiáng)度即平均積分光密度進(jìn)行圖像分析結(jié)果分別是：2.94±0.36，8.53±0.90，7.32±1.22，6.87±0.51，5.59±0.53，4.53±0.38，4.64±0.40，單因素方差分析結(jié)果顯示1、2、5周齡組的AnxA1免疫組化染色強(qiáng)度與其余各組均存

5、在顯著性差異(P＜0.01)，3周齡與4周齡間(P=0.26，＞0.05)、6周齡與8周齡間(P=0.78，＞0.05)無顯著性差異，它們與其余組間存在顯著性差異(P＜0.01)。顯示AnxA1蛋白在1周齡小鼠睪丸中表達(dá)較低，2周齡后表達(dá)升高并達(dá)到峰值，而后逐漸下降，至6～8周趨于平穩(wěn)。對(duì)AnxA1mRNA進(jìn)行半定量RT-PCR，以β-actin為內(nèi)參照，表達(dá)強(qiáng)度分別是：0.87±0.09，1.94±0.16，1.66±0.10，1.6

6、0±0.09，1.38±0.05，116±0.1，1.10±0.06，單因素方差分析結(jié)果顯示1、2、5周齡組的AnxA1mRNA水平與其余各組均存在顯著性差異(P＜0.01)，3周齡與4周齡間(P=0.36，＞0.05)、6周齡與8周齡間無顯著性差異(P=0.35，＞0.05)，它們與其余組間存在顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果表明AnxA1蛋白及mRNA在小鼠睪丸的表達(dá)水平出現(xiàn)加齡變化，其變化趨勢(shì)相似。提示AnxA1與小鼠生精細(xì)胞的增

7、殖分化以及睪丸出生后發(fā)育成熟有關(guān)。 2.膜聯(lián)蛋白A1在小鼠精子中的定位 用間接免疫熒光染色對(duì)取自小鼠生精管道中不同部位的精子以及處于不同生理狀態(tài)的精子進(jìn)行AnxA1定位，以期了解AnxA1與精子睪丸后成熟、獲能、項(xiàng)體反應(yīng)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)取自睪丸、附睪頭、體、尾部的精子AnxA1均分布于項(xiàng)體帽區(qū)及尾部，不同部位的精子AnxA1分布無明顯差別。對(duì)誘導(dǎo)獲能、頂體反應(yīng)的精子進(jìn)行AnxA1免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)根據(jù)頭部熒光分布特點(diǎn)分為2

8、種類型：項(xiàng)體帽區(qū)標(biāo)記型(Acrosomalcap)，簡(jiǎn)稱“Cap"型；赤道段-頂體后區(qū)標(biāo)記型(Equatorialsegment-postacrosomalarea，Ep)，簡(jiǎn)稱“Ep"型。獲能培養(yǎng)組的精子"Cap"型百分率為97.3±1.04％，“Ep"型為2.7±1.04％；誘導(dǎo)項(xiàng)體反應(yīng)組的精子"Cap"型百分率為41.8±4.09％，“Ep"型為58.2±4.09％。同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定精子頂體反應(yīng)率，發(fā)現(xiàn)獲能培養(yǎng)組頂體完整的

9、精子百分率為94.6±2.51％，頂體反應(yīng)率為5.4±2.51％；誘導(dǎo)頂體反應(yīng)組頂體完整的精子百分率為353±3.68％，項(xiàng)體反應(yīng)率為64.7±3.68％。結(jié)果表明AnxAl熒光"Cap"型百分率與考馬斯亮藍(lán)染色鑒定的頂體完整的精子百分率相近，“Ep"型與項(xiàng)體反應(yīng)的精子百分率相近。用膠體金間接免疫電鏡技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)獲能、頂體反應(yīng)的精子進(jìn)行AnxAl定位發(fā)現(xiàn)，頂體反應(yīng)初期精子膠體金標(biāo)記主要表現(xiàn)為"Cap"型，而項(xiàng)體反應(yīng)后期接近完成時(shí)主要表現(xiàn)為

10、“Ep”型，分布區(qū)域與免疫熒光定位結(jié)果類似。項(xiàng)體完整的精子未見膠體金標(biāo)記。綜合光電鏡結(jié)果，提示獲能后精子AnxAl分布無明顯變化，仍分布于頂體帽區(qū)及尾部；而項(xiàng)體反應(yīng)后的精子，AnxAl主要分布于赤道段及頂體后區(qū)。 3.膜聯(lián)蛋白A1與小鼠體外受精的關(guān)系 首先利用RT-PCR技術(shù)克隆了小鼠睪丸全長(zhǎng)AnxAlcDNA，將其與表達(dá)載體pGEX-5T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并用0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)。利用GST親

11、和層析柱純化融合蛋白GST-AnxAl，并用凝血酶切除GST，將純AnxA1蛋白免疫家兔，獲得抗血清并初步純化免疫球蛋白，ELISA檢測(cè)AnxA1抗血清效價(jià)，Western-Blot檢測(cè)抗血清的特異性。結(jié)果顯示，RT-PCR產(chǎn)物電泳可見1041bp的片段，與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致，測(cè)序結(jié)果與小鼠AnxA1cDNA序列完全一致；融合蛋白GST-AnxA1在細(xì)菌中高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量約占菌體蛋白總量的30％，主要為可溶性形式。融合蛋白經(jīng)親和層析純化

12、后電泳可見63KD的條帶，與預(yù)期分子量相符，純度達(dá)90％以上；用凝血酶除去GST，電泳可見37KD的條帶，與預(yù)期AnxA1分子量相符。免疫家兔后用ELISA檢測(cè)AnxA1抗血清效價(jià)達(dá)1：47，Western-Blot檢測(cè)AnxA1抗血清特異性，發(fā)現(xiàn)AnxA1抗血清可特異結(jié)合重組AnxA1。同時(shí)研究了AnxA1多抗對(duì)小鼠體外受精的影響。用制備的兔抗小鼠AnxA1多抗處理獲能前及獲能后小鼠精子，并進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn)，以陰性兔血清為對(duì)照，以受精

13、率為指標(biāo)，研究AnxA1多抗對(duì)精子穿含透明帶卵及去透明帶卵有否影響。結(jié)果顯示AnxA1多抗處理獲能前精子，含透明帶卵受精率為67.47±9.14％，陰性對(duì)照組為64.39±7.99％；去透明帶卵受精率為85.48±5.51％，陰性對(duì)照組為87.67±4.71％。AnxA1多抗處理獲能后精子，含透明帶卵受精率為70.79±4.51％，陰性對(duì)照組為74.07±7.06；去透明帶卵受精率為86.09±3.94，陰性對(duì)照組為88.15±577。

14、方差分析結(jié)果顯示AnxA1多抗處理組與陰性對(duì)照組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。表明AnxA1多抗對(duì)精子穿透含透明帶卵及去透明帶卵均無明顯影響。 結(jié)論: 1膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸中的表達(dá)具有時(shí)空變化規(guī)律，可能與小鼠生精細(xì)胞的增殖分化及睪丸出生后發(fā)育成熟有關(guān)。 2取自小鼠生精管道中不同部位的精子AnxA1均分布于項(xiàng)體帽區(qū)及尾部，不同部位的精子AnxA1分布無明顯差別。獲能后精子AnxA1分布無明顯變化，頂