MSTN在DEHP母體暴露引起子代肌肉發(fā)育抑制中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　塑化劑，又稱鄰苯二甲酸酯類化合物(Phthalate Esters，PAEs)，是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對生殖、肝腎功能、胚胎發(fā)育等多方面均有潛在的危害作用。目前，人們對塑化劑的研究主要集中在其對人體代謝以及生殖等方面，關(guān)于塑化劑對骨骼肌發(fā)育的影響鮮有報道。前期我們課題組研究發(fā)現(xiàn)塑化劑DEHP母體暴露后，仔鼠體重以及骨骼肌重量較對照組均明顯減少，肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)在DEHP母體暴露的仔

2、鼠肌肉中表達顯著上調(diào)，提示MSTN可能在DEHP暴露引起的肌肉發(fā)育抑制中發(fā)揮作用。本研究利用Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建骨骼肌中MSTN基因特異性敲除小鼠模型，進一步研究MSTN在DEHP母體暴露引起子代肌肉發(fā)育抑制中的作用及相關(guān)分子機制。
　　方法：
　　1.利用Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建骨骼肌中MSTN基因特異性敲除的小鼠模型，用PCR法進行基因型鑒定。
　　2.在特定時間點（0、7、14、21天）分別測量野生型與MST

3、N基因敲除小鼠的體重，觀察兩組小鼠體重的變化;免疫熒光法檢測兩組小鼠腿部骨骼肌纖維橫截面積的大小;RT-qPCR法檢測兩組小鼠股四頭肌中Atrogin-1、MuRF-1等肌肉降解相關(guān)基因mRNA的表達。
　　3.分別構(gòu)建野生型、MSTN基因敲除孕鼠模型，分成4組:野生型+玉米油(WT-con組)，野生型+DEHP染毒（WT-DEHP組），MSTN基因敲除+玉米油(KO-con組)以及MSTN基因敲除+DEHP染毒（KO-DEHP組

4、），DEHP與玉米油均采用隔天灌胃的方法，從觀察到陰栓時開始灌胃，灌胃時間至子代小鼠斷奶（第21天），在特定時間（0、7、14、21天）分別測量小鼠體重，觀察兩組小鼠體重變化，稱取骨骼肌重量，RT-qPCR法檢測骨骼肌合成與降解相關(guān)基因mRNA的表達。
　　4.為了進一步探討DEHP影響骨骼肌發(fā)育的具體機制，采用CCK-8法檢測不同濃度(0、62.5、125、250、500、1000μM)MEHP（DEHP活性代謝產(chǎn)物）處理不同時

5、間(48、72、96h)對骨骼肌細胞C2C12增殖的影響;RT-qPCR法檢測MEHP對蛋白質(zhì)合成與降解相關(guān)基因mRNA表達的影響;熒光素酶標(biāo)記法檢測MEHP對MSTN啟動子的影響;采用siRNA干擾技術(shù)干擾C2C12細胞中的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPδ，觀察MEHP對其相關(guān)基因mRNA表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，MSTN基因敲除后仔鼠體重及骨骼肌重量均顯著增加，尤以第7和21天最為明顯（P＜0.05）;免疫熒光

6、結(jié)果顯示MSTN基因敲除組（KO組）仔鼠的肌纖維橫截面積較對照組（WT組）增大（P＜0.01）;RT-qPCR結(jié)果提示KO組肌肉降解相關(guān)分子Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達水平較WT組下降（P＜0.01）。
　　2.在特定時間點（0、7、14、21天）分別檢測4組仔鼠的體重及骨骼肌重量，結(jié)果顯示W(wǎng)T-DEHP組仔鼠的體重與骨骼肌重量較WT-Con組明顯降低，而KO-DEHP組與KO-Con組相比則降低不明顯。

7、　　3.RT-qPCR檢測4組仔鼠相關(guān)基因表達情況，結(jié)果顯示W(wǎng)T-DEHP組仔鼠的肌肉降解因子Atrogin-1和MuRF-1mRNA表達水平較WT-Con組升高，肌肉合成因子MyoD和Myogenin表達下降，而KO-DEHP組仔鼠較KO-Con組的Atrogin-1和MuRF-1并沒有明顯升高，MyoD和Myogenin也沒有明顯下調(diào);Western blot檢測仔鼠肌肉，WT-DEHP組仔鼠的MyoD和p-Akt蛋白水平低于WT-

8、Con組，而KO-DEHP組仔鼠MyoD和p-Akt蛋白水平較KO-Con組沒有降低，這些結(jié)果均說明DEHP母體暴露抑制子代骨骼肌的發(fā)育通過了MSTN分子的介導(dǎo)。
　　4.用MEHP（DEHP代謝產(chǎn)物）處理骨骼肌細胞C2C12，CCK-8實驗結(jié)果顯示，隨著MEHP濃度的增加以及暴露時間的延長，C2C12細胞的增殖活性顯著降低，說明MEHP對骨骼肌細胞C2C12的增殖有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)時間和劑量依賴效應(yīng);熒光素酶標(biāo)記結(jié)果顯示M

9、EHP組(125、500μM)的熒光相對表達量均較對照組高（P＜0.05），說明MEHP激活了MSTN的啟動子;同時，與動物實驗結(jié)果一致，RT-qPCR結(jié)果顯示C2C12細胞經(jīng)MEHP處理后，MSTN、Atrogin-1和MuRF-1的mRNA水平表達均升高（P＜0.05），而MyoD和Myogenin的表達均下調(diào)（P＜0.05）;此外，MEHP組中轉(zhuǎn)錄因子C/EBPδ的mRNA表達水平較對照組升高。
　　5.利用siRNA技術(shù)干

10、擾C2C12細胞中C/EBPδ的表達，再經(jīng)MEHP處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾C/EBPδ不僅明顯抑制了MEHP對MSTN以及Atrogin-1、MuRF-1等肌肉降解因子表達的上調(diào)，同時也抑制了MEHP對MyoD、Myogenin等肌肉合成因子表達的下調(diào)，說明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPδ在MEHP上調(diào)C2C12細胞中MSTN表達中發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：
　　1.利用Cre-LoxP技術(shù)成功構(gòu)建了骨骼肌中MSTN基因特異性敲除的小鼠模型。MS

11、TN基因敲除導(dǎo)致仔鼠體重以及骨骼肌重量增加，肌纖維增大，其原因可能與肌肉降解因子Atrogin-1與MuRF-1等表達下調(diào)有關(guān)。
　　2.MSTN在DEHP母體暴露引起子代肌肉發(fā)育抑制中發(fā)揮作用。MSTN敲除后，DEHP引起的子代肌肉發(fā)育抑制作用減弱，肌肉合成相關(guān)分子MyoD和Myogenin表達增加，肌肉降解相關(guān)分子Atrogin-1和MuRF-1表達減少，MyoD和p-Akt蛋白水平增加。
　　3.DEHP活性代謝產(chǎn)物M