煙草DCL基因的抗病調(diào)控功能分析.pdf

1、DCL(Dicer-like)是一類(lèi)保守的dsRNA特異性核糖核酸內(nèi)切酶，其在RNA降解、轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控和抗病毒侵染等方面具有重要作用。目前已知的植物DCL基因信息及其抗病調(diào)控功能研究主要集中在擬南芥、水稻和楊樹(shù)上，其它植物上的相關(guān)研究很少。煙草是重要經(jīng)濟(jì)作物，也是植物與病原菌互作研究的經(jīng)典植物材料。
　　 本研究分析了普通煙(Nicotiana tabacum)和本氏煙(N.benthamiana)DCL的抗病調(diào)控功能，獲

2、得以下主要研究結(jié)果:
　　 (1)獲得了4個(gè)煙草DCL基因的RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株。本研究構(gòu)建了適用于煙草轉(zhuǎn)化的、分別包含4個(gè)煙草DCL基因片段發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi載體。利用組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得了各NtDCL基因RNAi(RNAi-NtDCL)轉(zhuǎn)基因普通煙植株:RNAi-NtDCL1植株67株，RNAi-NtDCL2植株33株，RNAi-NtDCL3植株27株，RNAi-NtDCL4植株31株。對(duì)插入的T-DNA上NPTⅡ基

3、因片段和發(fā)夾結(jié)構(gòu)內(nèi)含子pBS-IN片段的PCR檢測(cè)分析得出，4類(lèi)NtDCL基因RANi結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率約為55％。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)基因株系中DCL基因沉默效果，發(fā)現(xiàn)NtDCL(1-4)表達(dá)量分別受到不同程度的抑制，沉默效果較好的株系中，其相應(yīng)DCL表達(dá)量只有對(duì)照的1/10左右。對(duì)RNAi-NtDCL植株的表型分析結(jié)果顯示，NtDCL1基因的RNAi影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，但NtDCL2、NtDCL3、ⅣDCL4的RNAi對(duì)煙

4、草生長(zhǎng)發(fā)育的影響不大。NtDCL1基因沉默后，抑制植物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株矮小，葉片畸形（新葉增生），老葉細(xì)長(zhǎng)、破損，花葉和根系不發(fā)達(dá)等。
　　 (2)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了DCL基因在煙草不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明:在煙草中4個(gè)不同DCL基因表達(dá)具有組織特異性。同一DCL基因在同種植物不同組織中表達(dá)不同:在花器中表達(dá)水平較高，而在營(yíng)養(yǎng)器官如莖、葉肉、葉脈中表達(dá)水平較低。不同DCL基因在同一植物組織中表達(dá)量不同:本氏煙莖、

5、葉肉、葉脈中DCL基因的表達(dá)量高低次序依次為:DCL2＞DCL1＞DCL4＞DCL3，且DCL2表達(dá)量顯著高于其它DCL基因。同一基因在不同植物相同組織中，其表達(dá)量也存在一定差異。在莖和葉脈等維管束組織中，普通煙DCL(1-4)基因表達(dá)量均高于本氏煙，在葉肉和花器中，這一規(guī)律并不明顯。
　　 (3)采用瞬時(shí)RNAi技術(shù)研究了DCL基因?qū)χ参镞^(guò)敏反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)和抗病性的調(diào)控功能。與非R

6、NAi處理部位相比，DCL(1-3)的RNAi處理部位中，表達(dá)Cf-4/Avr4的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)組織綠色更深;接種煙草野火病菌(Pseudomonassyringae pv.tabaci，Pst)后發(fā)病更快、病害癥狀更嚴(yán)重;但接種菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum，Ss)后病害癥狀減輕。但DCL4作用并不明顯。研究結(jié)果表明，DCL(1-3)基因在煙草對(duì)Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR和Ss抗病性中起負(fù)調(diào)控作用，而對(duì)Pst抗