水稻第8染色體著絲粒區(qū)域基因-DCL的功能分析.pdf

1、著絲粒是真核生物染色體基本的結構與功能元件，每條染色體必須擁有活性著絲粒才能保證染色體有絲分裂與減數(shù)分裂的正常進行、遺傳物質的正常傳遞。長期以來，著絲粒區(qū)域被認為含有大量重復序列，屬于染色質上的轉錄沉默區(qū)，并且著絲粒及其側翼區(qū)域的重組是高度受抑制的，所以經(jīng)典遺傳學認為著絲粒區(qū)域不存在功能基因。然而近年來研究表明，著絲粒區(qū)域有活性基因的存在。水稻是世界上重要的糧食作物之一，也是單子葉植物的模式生物。隨著水稻全基因組測序的完成，水稻不同染色

2、體著絲粒區(qū)域活性基因的組成也進行了初步分析。其中不含有大量衛(wèi)星重復序列的水稻第8著絲粒是揭示著絲粒區(qū)域特征的最理想的模型，在水稻第8染色體功能著絲粒區(qū)有16個活性基因，但相關基因的功能很少見報道。
　　水稻葉色的變化是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結果，其中遺傳因素通常與葉綠素的合成與降解、葉綠體的形成及發(fā)育等相關。水稻葉色變化主要有白化、黃化、淡綠、黃綠、條紋等類型。水稻中有許多與葉色相關的基因，分布在水稻的各條染色體上，然而關于

3、著絲粒區(qū)域與葉色相關基因的報道還很少。本實驗室在前期研究中獲得水稻品種中秈3037著絲粒DNA序列缺失材料，該材料缺失純合體無法在大田條件下正常生長，初步確定該著絲粒區(qū)域存在重要功能基因。本實驗以該材料為基礎，繼續(xù)開展相關研究，明確了該材料在第8染色體著絲粒區(qū)域發(fā)生缺失與表達差異的6個候選基因，并重點對葉色相關基因DCL(defective chloroplasts and leaves)的功能進行初步分析。主要研究結果如下:
　

4、　1.經(jīng)FISH分析明確著絲粒序列缺失片段發(fā)生在第8染色體上，在該區(qū)域沒有水稻著絲粒特異序列CentO的信號。
　　2.進一步通過PCR和RNA-seq分析確定第8染色體的著絲粒缺失片段在LOC_Os08g21541至LOC_Os08g21710之間，大小約為171kb，在該區(qū)域包含6個活性基因，其中LOC_Os08g21700為葉色相關基因DCL的侯選基因。
　　3.構建6個缺失基因的RNAi載體，并重點對已經(jīng)獲得的著絲粒

5、區(qū)域控制葉色的DCL基因的RNAi材料進行基因表達分析。結果表明RNAi材料中DCL基因的表達均顯著下降。
　　4.進一步對DCL-RNAi材料進行表型觀察。結果顯示DCL-RNAi材料葉片黃化，并在株高、分蘗數(shù)、結實率和千粒重等方面發(fā)生顯著變化。
　　5.通過葉綠素含量的測定及葉綠體電鏡掃描分析表明，DCL-RNAi材料的葉片中總葉綠素含量及葉綠素各組分含量均顯著降低;DCL基因與葉綠體的形成發(fā)育相關。
　　6.對水

6、稻中葉綠體形成發(fā)育相關及光合作用等相關的基因進行表達量分析。結果表明，只有編碼NADPH原葉綠素酸酯氧化還原酶的基因LOC_Os04g58200在DCL-RNAi材料中的表達量較野生型顯著降低，其他基因在野生型和DCL-RNAi材料中的表達量無顯著差異。
　　7.表達分析及GUS染色結果表明，DCL基因在根、莖、葉和穗等組織中均有表達。GFP融合蛋白在水稻原生質體中的瞬時表達表明，DCL蛋白是一個核蛋白。
　　8.構建DCL