STAT1-3與ERK1-2通路協(xié)同調(diào)控高糖誘導的鼠CFs增殖和膠原合成.pdf

1、背景：糖尿病的發(fā)病率逐年增高，席卷全球。糖尿病心肌病作為糖尿病的嚴重并發(fā)癥，其高發(fā)病率和致死率已引起人們的高度警覺和關(guān)注，促使越來越多的學者致力于深入研究，以期能更好地防范其發(fā)生發(fā)展，改善人們的生活質(zhì)量，延長生存壽命。在諸多環(huán)節(jié)中，心肌纖維化是糖尿病心肌病的一個重要的病理過程，其主要特點表現(xiàn)為在心臟組織中，心肌成纖維細胞過度增殖和細胞外基質(zhì)成分（如膠原等）在組織間隙過多的沉積，使心室壁僵硬，故而引起心臟收縮與舒張功能障礙，促進了心力衰竭

2、的進展。高糖亦可促進體外培養(yǎng)的心肌成纖維細胞異常增殖和膠原沉積，然而其相關(guān)的分子機制目前尚不完全清楚。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，許多細胞因子和生長因子都是利用了該信號轉(zhuǎn)導通路從而進一步誘導細胞的增殖、分化和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，STAT信號通路參與了多種原因所致的心肌受損后的病生理反應(yīng)過程，并且也介導了肺、肝臟、腎臟組織的纖維化病變，尤其是介導了高糖所導致的腎臟組織的纖維化。然而STAT信號通

3、路是否也參與調(diào)控了高糖所引起的心臟組織纖維化目前尚不清楚。本研究擬對STAT通路在高糖誘導下心肌成纖維細胞增殖過程中的調(diào)控作用及與細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2）信號通路的相互關(guān)系做一些觀察與摸索，試圖為用這兩條信號通路調(diào)控心肌纖維化增殖及未來防治糖尿病心肌纖維化提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。
　　目的：觀察高糖對心肌成纖維細胞增殖的影響和對Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達及膠原蛋白表達的影響，驗證高糖對心肌成纖維細胞增殖與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達

4、的促進作用。觀察高糖是否可誘導心肌成纖維細胞中STAT1與STAT3磷酸化蛋白的表達，觀察抑制STAT1與STAT3信號后對心肌成纖維細胞增殖的作用及對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，明確是否STAT通路介導了高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖和膠原合成。觀察抑制ERK1/2通路后對心肌成纖維細胞增殖的作用及對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，驗證ERK1/2通路對高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的調(diào)控作用。分別觀察聯(lián)合抑制STAT1與E

5、RK1/2、STAT3與ERK1/2信號通路后對心肌成纖維細胞增殖的作用及對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，明確是否STAT1、STAT3與ERK1/2在調(diào)控高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的過程中存在協(xié)同作用。
　　方法：由出生1～3d的SD幼鼠心尖組織培養(yǎng)獲取第2-4代心肌成纖維細胞。將心肌成纖維細胞分為：高滲組、正常糖組、正常糖+氟達拉濱（FLU）組、正常糖+S3I-201組、高糖組、高糖+FLU組、高糖+S3I-

6、201組、高糖+PD98059組、高糖+FLU+PD98059組、高糖+S3I-201+PD98059組。正常糖+FLU組和高糖+FLU組中加入STAT1抑制劑FLU干預(yù)。正常糖+S3I-201組和高糖+S3I-201組中加入STAT3抑制劑S3I-201干預(yù)。高糖+PD98059組加入ERK1/2抑制劑PD98059干預(yù)。高滲組細胞放置于含5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L甘露糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MTT比色法檢測

7、心肌成纖維細胞的增殖情況。定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平。ELISA法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達水平。蛋白印跡法檢測磷酸化STAT1（p-STAT1）和磷酸化STAT3（p-STAT3）的表達水平。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)12h與24h，高糖組中Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達增加；體外培養(yǎng)24h與72h，高糖組中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達增加，且心肌成纖維細胞增殖活躍；體外培養(yǎng)60min與120min，高糖組中p-S

8、TAT1表達增加；體外培養(yǎng)30min，高糖組中p-STAT3表達減少，培養(yǎng)60min與120min，高糖組中p-STAT3表達增加；p-STAT3增加程度較p-STAT1明顯。氟達拉濱與S3I-201均能抑制高糖組中心肌成纖維細胞增殖；氟達拉濱與S3I-201均能抑制高糖組中Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA及膠原蛋白的表達；體外培養(yǎng)12h，氟達拉濱對高糖組中Ⅰ型前膠原表達有更強的抑制作用，S3I-201對高糖組中Ⅲ型前膠原表達有更強的抑制作用；而

9、體外培養(yǎng)24h， S3I-201對高糖組中Ⅰ型前膠原表達有更強的抑制作用；分別聯(lián)合抑制STAT1與ERK1/2、STAT3與ERK1/2后對心肌成纖維細胞增殖較分別單獨抑制有更強的抑制作用；對Ⅰ型膠原蛋白的表達有更強的抑制作用。
　　結(jié)論：高糖促進心肌成纖維細胞增殖與Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。高糖可誘導心肌成纖維細胞中STAT1與STAT3磷酸化蛋白的表達，二者表達的程度與方式不同， STAT1與STAT3可能以不同方式介導了高糖誘導的