

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文檔簡介
1、傳統(tǒng)觀點認為脂肪組織是作為能量儲存器官,在能量吸收大于消耗時儲存能量,而在能量不足時提供能量。但現在越來越多的研究證實,脂肪組織也是一個重要的內分泌器官,它可以通過合成和分泌脂肪因子參與到很多生理和病理過程中,如可以影響其他器官組織的代謝,食欲,胰島素敏感性,免疫,和血管疾病等。這些脂肪因子包括脂聯素、瘦素、TNF-α、IL-6、內脂素等。
Chemerin,作為一個新近發(fā)現的脂肪因子,主要在胎盤、肝臟、白色脂肪組織中高表達。
2、它通過與它的G蛋白偶聯受體CMKLR1(又叫ChemR23)結合來參與到炎癥反應、脂質代謝、血管功能紊亂等生理或病理活動中。流行病學調查顯示,血漿chemerin水平與體重指數(BMI)及甘油三酯水平密切相關,且在高脂飲食小鼠體內,血漿chemerin表達水平顯著升高。在前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞轉化的過程中,也觀察到細胞chemerin含量上升。相反地,CMKLR1缺陷的小鼠則顯示出脂肪生成能力受損,且使用RNAi敲低chemerin
3、/CMKLR1的表達會抑制前體脂肪細胞向成鼠脂肪細胞的分化。這些結果顯示,chemerin在脂肪分化、生成中發(fā)揮重要的作用。還有一些研究顯示,chemerin也參與到血管功能調節(jié)中,體外血管生成試驗中,chemerin能夠顯著促進毛細血管樣結構形成,增加微血管長度與數量。但是,chemerin對于脂肪生成及血管形成的作用機制仍未被闡明。脂肪生成是一個很復雜的過程,它涉及到基因背景及環(huán)境因素,還有眾多的細胞因子、信號通路參與其中等。脂肪組
4、織的生長也需要血管來提供營養(yǎng),且脂肪生成和血管生成是一個緊密聯系、相輔相成的過程。因此,找到一個合適的能夠且同時研究脂肪生成和血管生成聯系點的模型是很有必要的。將3T3-F442A細胞注射在裸鼠皮下,能夠長成一個成熟脂肪墊,這個脂肪墊在外觀上與正常脂肪細胞幾乎無差異,并且脂肪墊中充滿新生血管,因此,這個脂肪墊是一個理想的同時研究脂肪生成和血管生成的模型。
在真核生物中,針對轉錄水平的干預是有重大意義的。Gax,又名同型異源盒基
5、因,是一個轉錄抑制因子,主要在心血管系統(tǒng)中個體發(fā)育、器官形成、細胞生長、分化和遷移中起重要作用。以往有研究顯示Gax參與到血管生成和脂肪分化中。但Gax基因能否調節(jié)chemerin對于脂肪生成和血管生成的作用還未知。
綜上所述,我們提出這樣的假設,chemerin通過激活某種信號轉導網絡來促進脂肪生成和血管生成,而轉錄抑制因子Gax基因能夠在體外和體內模型中有效表達,并且能夠阻斷chemerin所介導的信號通路轉導及脂肪生成和
6、血管生成。
第一部分 體外試驗檢測Chemerin和Gax對于3T3-F442A前體脂肪細胞生物學功能影響的機制
方法
1.實驗分組:
(1)根據chemerin的濃度分組:為了檢驗不同濃度梯度下chemerin對于前體脂肪細胞生物學功能的影響,按照chemerin的濃度將前體脂肪細胞分為6個組:0ng/ml(空白對照組)組、20ng/ml組、40ng/ml組、60ng/ml組、80ng/ml組和
7、100ng/ml組。
(2)根據有無Akt通路抑制劑(LY294002)及chemerin分組:PBS組(空白對照組)、LY294002組、chemerin組和LY294002+chemerin組。
(3)根據有無ERK1/2通路抑制劑(PD98059)及chemerin分組:PBS組(空白對照組)、PD98059組、chemerin組和PD98059+chemerin組。
(4)按有無chemerin腺病
8、毒和(或)Gax腺病毒分組:Ad-GFP對照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad-Gax組和Ad-Gax組。
2.MTT法:檢測不同處理組的細胞增殖情況。
3.流式細胞術:檢測不同處理組的細胞周期分布情況。
4.油紅O染色:檢測不同處理組的前體脂肪細胞分化情況。
5.蛋白免疫印跡分析:檢測不同處理組的相關蛋白如:FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、Akt/m
9、TOR和ERK1/2通路的表達情況。
6.細胞免疫熒光染色:檢測TRITC標記的相關蛋白在細胞的表達情況。
結果:
1.Chemerin對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實,與空白對照組相比,各濃度的chemerin均能夠有效地促進前體脂肪細胞的增殖,且促進前體脂肪細胞增殖的能力隨著chemerin滴度的增加而逐漸增加。
2.LY294002對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實
10、,與空白對照組相比,LY294002(20um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細胞的增殖,且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞增殖。
3.PD98059對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實,與空白對照組相比,PD98059(40um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細胞的增殖,且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞增殖。
4.LY294002對于前
11、體脂肪細胞分化的影響:通過油紅O實驗證實,與空白對照組相比,LY294002(20um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細胞的分化,且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞分化。
5.PD98059對于前體脂肪細胞分化的影響:通過油紅O實驗證實,與空白對照組相比,PD98059(20um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細胞的分化,且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞分化
12、。
6.重組腺病毒的轉染:經過72小時的轉染,幾乎所有的細胞都能夠高表達GFP,且細胞免疫熒光顯示Gax集中表達在胞核而chemerin主要表達在胞質。
7.Chemerin和Gax對于細胞周期和細胞增殖與凋亡的影響:
(1)Chemerin對于細胞周期和凋亡的影響:與Ad-GFP對照組相比,在Ad-chemerin組,G2/M期細胞比例增加、細胞凋亡減少。
(2)Gax基因對細胞周期和凋亡的影響
13、:與Ad-GFP對照組相比,在Ad-Gax組,GO/G1期細胞比例增加、G2/M期細胞比例降低、細胞凋亡增加。
(3)Gax對于chemerin所介導促進細胞周期和凋亡的影響:與Ad-chemerin組相比,在Ad-chemerin+Ad-Gax組,GO/G1期細胞比例增加、G2/M期細胞比例降低、細胞凋亡增加。
8.Chemerin和Gax對于細胞分化的影響:油紅O試驗顯示:與空白對照組相比,Gax基因能夠有效地抑
14、制前體脂肪細胞的分化,且能夠有效地抑制chemerin的促進前體脂肪細胞分化。
9.相關細胞因子及信號通路的表達情況:
(1)Wertemblot:chemerin組與空白對照組比較,FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達增加,LY294002組與空白對照組相比較,FABP4、VEGF、p-Akt、p-mTOR、p-p7
15、0S6K和p-4EBP1的表達降低,PD98059組與空白對照組相比較,FABP4、VEGF、p-ERK1/2的表達降低,而LY294002+chemerin組和PD98059+chemerin組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對照組相比較無統(tǒng)計學差異;Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較,FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR
16、1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達增加,Ad-Gax組與Ad-GFP組相比較,FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP的表達降低,而Ad-Gax+Ad-chemerin組和Ad-GFP組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對照組相比
17、較無統(tǒng)計學差異。(2)細胞免疫熒光的統(tǒng)計學結果也與werstemblot相同。
結論:
1.Chemerin能夠通過Akt/mTOR和ERK1/2通路促進前體脂肪細胞的增殖和分化。
2.Chemerin能夠促進細胞周期進程,而Gax能夠促進細胞凋亡,抑制細胞周期且能夠削弱chemerin的促周期作用。
3.Gax能夠抑制chemerin的促進分化作用。
4.Gax能夠抑制chemerin
18、的促進Akt/mTOR和ERK1/2通路激活作用。
第二部分 體內試驗檢測Chemerin和Gax對于脂肪及血管生成的影響
方法:
(1)模型的建立:將2x107個3T3-F442A細胞注射到裸鼠背部皮下,分別在1周、4周、7周、10周時處死裸鼠,然后觀察不同時間段脂肪墊的生長情況。
(2)模型分組:將裸鼠隨機分為4個組:Ad-GFP對照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad
19、-Gax組和Ad-Gax組。將2x107個3T3-F442A與相應重組腺病毒毒液混合后注射到裸鼠背部皮下。
(3)動物活體成像儀檢測:成模第3天時,使用動物活體成像儀檢測GFP表達情況。
(4)顯微結構及免疫組化檢測:成模2周時,處死裸鼠。分別對不同處理組的脂肪墊進行顯微結構檢測。使用免疫組化對不同脂肪墊行FABP4、VEGF、CD31、p-ERK1/2、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1檢測
20、。
(5)蛋白免疫印跡分析:檢測不同處理組脂肪墊的磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達情況。
結果:
(1)模型的建立:H&E染色顯示:在成模1周時,注射的3T3-F442A細胞仍保持成纖維細胞形態(tài);在4周時,一些前體脂肪細胞已經轉化成脂肪細胞形態(tài);7周時,大多數前體脂肪細胞已經轉化成脂肪細胞形態(tài);10周時,幾乎全部前體脂肪細胞都轉化成脂肪細胞形態(tài),并且與正常脂肪組織的形態(tài)分
21、辨不出來差別。
(2)腺病毒體內轉染效率:在成模第3天時,使用動物活體成像儀可以清晰地檢測到GFP熒光表達。
(3)H&E染色顯示:Ad-chemerin組的脂肪形態(tài)細胞數量較多且存在較多的血管,而Ad-Gax組的細胞壞死較多且?guī)缀跤^察不到血管的存在。
(4)免疫組化檢測:①相比較Ad-GFP對照組,在Ad-chemerin組的脂肪墊中,VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是增加的;②相比較A
22、d-GFP對照組,在Ad-Gax組的脂肪墊中,VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是降低的;③相比較Ad-Ad-chemerin+Ad-Gax組,在Ad-Gax組的脂肪墊中,VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是降低的。④蛋白免疫印跡分析和免疫組化檢測均顯示:Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較,磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達增加。Ad-Gax組與Ad-GFP組比
23、較,磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達降低。
結論:
(1)使用3T3-F442A細胞注射到裸鼠皮下可以成功構建脂肪墊模型,這個脂肪墊模型與正常脂肪組織幾乎無差別,且脂肪墊模型中充滿血管,這提供了一個能夠同時研究脂肪生成和血管生成的理想的模型。
(2)將腺病毒與3T3-F442A細胞混合后注入裸鼠皮下后,腺病毒在第3天時就可以被檢測到表達,且表達能夠至少穩(wěn)定存在2周。
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