Ⅰ類新城疫病毒NP和P基因分子流行病學(xué)研究及NDV08-004株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、本研究通過對2008～2010年分離到的60株Ⅰ類新城疫病毒分離株的NP和P蛋白基因進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，基本掌握了我國目前Ⅰ類新城疫病毒的分子特征。通過構(gòu)建Ⅰ類新城疫病毒代表株NDV08-004全長感染性cDNA克隆，并成功拯救出重組病毒，為Ⅰ類新城疫病毒的致病機(jī)理和相關(guān)蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 1．Ⅰ類新城疫病毒NP基因分子特征的研究
　　 本研究對2008～2010年分離到的60株Ⅰ類新城疫病毒的NP基因進(jìn)

2、行了分子特征和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果表明所有Ⅰ類新城疫病毒分離株完整NP基因的長度均為1746bp，編碼區(qū)長度為1470nt，可編碼489個(gè)氨基酸。通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)Ⅰ類NDV在NP蛋白基因上的特征性位點(diǎn)，如：D460E和S468T。同源性分析結(jié)果顯示，Ⅰ類與Ⅱ類NDV的NP蛋白氨基酸同源性在88.0％～92.7％之間，核苷酸同源性在75.2％～79.5％之間。遺傳進(jìn)化樹分析表明60株Ⅰ類NDV分離株可分為兩個(gè)不同的亞型，兩個(gè)亞型之間

3、NP蛋白氨基酸差異在2.7％～4.1％之間，核苷酸差異在4.6％～7.9％之間。
　　 2Ⅰ類新城疫病毒P基因分子特征的研究
　　 通過對60株Ⅰ類NDV分離株P(guān)基因的擴(kuò)增和分子遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果表明所有的分離株P(guān)基因長度均為1463bp，編碼區(qū)長度為1200nt，可編碼399個(gè)氨基酸。通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)Ⅰ類NDV在P蛋白基因上的特征性位點(diǎn)，如：E64D、G67D、N75Q、N81Q、E106D、F187Y、I24

4、5V、K304R、A311S、D340E、I354V、S374A。與Ⅱ類NDV相比，所有Ⅰ類NDV均在P基因的編碼區(qū)插入12nt。同源性分析結(jié)果顯示，Ⅰ類毒株與Ⅱ類毒株P(guān)蛋白的氨基酸同源性在64.5％～72.8％之間，核苷酸同源性在66.3％～72.2％之間。遺傳進(jìn)化分析表明60株Ⅰ類NDV可分為兩個(gè)不同的亞型，兩個(gè)亞型之間P蛋白氨基酸的差異在5.7％～9.7％之間，核苷酸差異在5.5％～7.8％之間。
　　 3．Ⅰ類新城疫病毒

5、拯救體系的建立
　　 3.1全長cDNA克隆以及輔助質(zhì)粒pCI-L的構(gòu)建
　　 通過設(shè)計(jì)7對特異性引物，將NDV08-004的基因組分為的7個(gè)不同的片段分別克隆至pGEM-Teasy載體，然后利用相應(yīng)的單酶切位點(diǎn)將7個(gè)片段依次亞克隆到LT-pOLTV5轉(zhuǎn)錄載體中，成功構(gòu)建了含NDV08-004全基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄載體NDV08-004-po，其中7022位C-T的突變可作為拯救病毒的“分子標(biāo)簽”。采用同樣的單酶切位點(diǎn)構(gòu)

6、建了表達(dá)L蛋白基因的輔助質(zhì)粒pCI-L。
　　 3.2NDV08-004的拯救
　　 采用構(gòu)建的三個(gè)輔助質(zhì)粒（pCI-NP、pCI-P和pCI-L）與基因組NDV08-004-po按照一定比例共轉(zhuǎn)染BSRT7/5細(xì)胞，通過將轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其上清接種SPF雞胚，結(jié)果成功拯救出了具有血凝性的r-NDV08-004，初代血凝價(jià)為21og2，傳代后血凝價(jià)達(dá)到71og2以上。通過對分子標(biāo)簽的測序驗(yàn)證證明了病毒的拯救。NDV08-004