新型重組新城疫病毒(NDV)表達(dá)系統(tǒng)的建立及最佳外源基因表達(dá)位置的確定.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染所引起的一種急性并有高度接觸性的禽類傳染病。ND自從被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)多次在世界范圍內(nèi)大型爆發(fā)過，對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了十分嚴(yán)重威脅，目前是世界上最嚴(yán)重的禽類傳染病之一。城疫病毒NDV按照致病型的不同一般分為三類，即速發(fā)型、中發(fā)型和緩發(fā)型。這其中，速發(fā)型NDV又可分為嗜內(nèi)臟型和嗜肺腦型。消化道出血性病變是速發(fā)性

2、嗜內(nèi)臟型NDV的主要特征，其致死率高達(dá)90％以上。自從NDV的反向遺傳系統(tǒng)被建立以來，已經(jīng)成功拯救多個NDV毒株。眾所周知，在表達(dá)載體相同的情況下，疫苗的免疫效果通常與所插入的具有免疫原性的外源基因的表達(dá)量息息相關(guān)。即外源基因表達(dá)量越高，免疫效果通常越好。但是，一般情況下，外源基因插入載體的位置不同，其表達(dá)量也會不同。NDV病毒載體傳統(tǒng)的外源基因攜帶方式是將目的基因插入到兩個病毒基因組基因之間，形成一個獨(dú)立的基因框架，增加了病毒基因的數(shù)

3、量。影響病毒的生長和復(fù)制。
　　為了進(jìn)一步確定外源基因的最佳表達(dá)位置，先后將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)-紅色熒光蛋白IRES-RFP插入到NDV rLaSota載體的NP基因內(nèi)部、P基因內(nèi)部、M基因內(nèi)部、F基因內(nèi)部、HN基因內(nèi)部以及L基因內(nèi)部，成功的構(gòu)建并拯救了一系列的外源基因(IRES-RFP)插入位置不同的重組NDV。通過分析TCID50、EID50、MDT、ICPI等多項生物學(xué)特性指標(biāo)得出，拯救病毒rLS-NP-IRES-RFP，r

4、LS-P-IRES-RFP，rLS-M-IRES-RFP，rLS-F-IRES-RFP，rLS-HN-IRES-RFP和rLS-L-IRES-RFP很好的保持了其親本病毒rLaSota弱毒株的生物學(xué)特性，并未發(fā)現(xiàn)任何毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。同時，病毒的生長曲線結(jié)果顯示，所有拯救病毒均表現(xiàn)出了與rLaSota病毒相似的復(fù)制特性及生長動力學(xué)特性。說明用IRES攜帶外源基因，插入在NDV基因組基因的尾部這一新的外源基因的攜帶方法對病毒的復(fù)制和生長幾乎

5、沒有任何影響，很好的解決了傳統(tǒng)方法將外源基因插入到基因組基因之間所帶來的影響病毒生長復(fù)制的弊端。之后，又采用多功能酶標(biāo)儀和Real-time PCR等檢測手段，在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平分別對重組病毒RFP基因的表達(dá)進(jìn)行了鑒定，實驗結(jié)果不僅首次系統(tǒng)直接的證實了新城疫病毒mRNA轉(zhuǎn)錄量是按照基因組3'至5'的順序逐次遞減的理論，更為重要的是，根據(jù)實驗結(jié)果，與其他外源基因插入位點(diǎn)相比較，當(dāng)IRES-RFP位于NDV rLaSota載體NP基因內(nèi)部