mtDNA誘導(dǎo)的PD-L1-PD-1信號分子對T細胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　1、觀察mtDNA對小鼠腹腔巨噬細胞PD-L1表達的影響；
　　2、以UO126(MEK1/2通路抑制劑)，SB203580(p38通路抑制劑)，SN50(NF-kB通路抑制劑)，LY294002(PI3K通路抑制劑)干預(yù)上述信號通路,篩選明顯抑制PD-L1表達的細胞通路，并用氯喹（chloroquine, CQ）作用于經(jīng)mtDNA刺激的巨噬細胞觀察p38信號通路的變化,探討巨噬細胞表達PD-L1的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通

2、路；
　　3、研究mtDNA誘導(dǎo)巨噬細胞對T細胞免疫活性的影響，并通過抗PD-L1單克隆抗體阻斷PD-L1/PD-1信號分子改善其對T細胞功能的抑制。
　　方法：
　　采用體外實驗研究。
　　1.根據(jù)mtDNA濃度，分為3組：空白對照組；1ug/ml mtDNA組；10ug/ml mtDNA。分別加入 PBS1ul;1ug/ml mtDNA和10ug/ml mtDNA，24小時提取各組，流式細胞術(shù)檢測PD-L1表

3、達。根據(jù)檢測時間不同分為6組，每組均加入10ug/ml mtDNA，分別在0小時、6小時、12,小時、24小時、48小時、72小時提取各組，流式檢測PD-L1表達。
　　2.將巨噬細胞分為5組：10ug/ml mtDNA組；UO126組；SB203580組；SN50組；LY294002組。給予10ug/mlmtDNA；其余4組在給予10ug/ml mtDNA1小時前分別給予信號傳導(dǎo)抑制劑：20uM UO126(MEK1/2),10

4、uMSB203580(p38MAPK),20uM SN50(NF-kB),25 uM LY294002(PI3K)，培養(yǎng)24小時后對各組檢測對象進行流式細胞術(shù)檢測PD-L1表達。根據(jù)流式細胞術(shù)所得結(jié)果，用Western blotting細胞內(nèi)信號通路檢測:將巨噬細胞分為2組：10ug/ml mtDNA組；10ug/ml mtDNA+CQ組。給予mtDNA前30分鐘加氯喹10 ug/ml，分別在0min、15min、30min、60min

5、及120min提取各項檢測對象進行Western blotting檢測。
　　3.10ug/ml mtDNA予小鼠腹腔巨噬細胞孵育24小時與磁珠分選(MACS)法得到的小鼠脾臟CD4+T細胞共培養(yǎng)。按巨噬細胞與 CD4+T細胞1:10比例混合培養(yǎng)于96孔圓底板中，處理48小時后收集各組懸浮細胞，酶標儀在450nm處檢測每個孔中的吸光度值[OD(450)]；根據(jù)ELISA試劑中的說明，72小時后收集各組細胞上清液檢測IFN-γ的含量

6、。所有資料以均值士標準差表示，運用 SPSS18.0軟件檢驗，多組間的比較應(yīng)選用單因素方差分析（one-wayANOVA），P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.流式細胞儀檢測不同濃度mtDNA對小鼠腹腔巨噬細胞PD-L1分子表達情況:24h時后對照組、1ug/ml mtDNA組與10ug/ml mtDNA組在巨噬細胞表面PD-L1表達量隨濃度增加而增加；10ug/ml mtDNA組隨時間變化，表達量逐步升高，

7、在給藥6小時后開始迅速升高，于24小時~72小時維持高峰狀態(tài)，72小時后緩慢下降，但仍處于較高水平，有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.SB203580組巨噬細胞PD-L1表達明顯降低，mtDNA（10ug/mL）組細胞的P-P38、P38蛋白表達隨時間逐高，加用氯喹組mtDNA刺激的巨噬細胞P-P38蛋白表達沒有上調(diào)。表明mtDNA通過TLR9調(diào)節(jié)下游p38細胞信號通路。
　　3.CD4+MΦ+mtDNA組和 CD4+MΦ+mtDNA

8、+anti-PD-L1組MTT OD值顯著高于前兩組，而且CD4+MΦ+mtDNA+anti-PD-L1組的增殖作用最明顯，與CD4+MΦ+mtDNA組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。加入a-PD-L1后，IFN-γ分泌水平明顯較CD4+MΦ+mtDNA組和CD4+MΦ+mtDNA+IgG1組高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA誘導(dǎo)巨噬細胞表達PD-L1，并成時間賴、濃度依性;
　　2.mtDNA通過TLR