腎移植受者PD-1-PD-L1信號通路在基礎和臨床研究.pdf

1、背景：負性調控共刺激分子PD-1(programmed death-1)為T、B淋巴細胞表面受體,屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,生理條件下在淋巴細胞表面少量表達,在T、B細胞抗原受體激發(fā)后呈誘導性表達。PD-1與其兩個配體PD-L1和PD-L2結合,在免疫應答中起著負性調控作用。關于PD-1/PD-L信號通路與臨床疾病的關系,如自身免疫性疾病、腫瘤、病毒感染、移植等,其表現(xiàn)的免疫調節(jié)作用受到越來越多的關注。
　　 目的：本

2、課題通過對比腎移植術前術后與健康對照者外周血單個核細胞表面PD-1的表達,了解PD-1與器官移植耐受的相關性；以及進一步探討腎移植術后發(fā)生急性排斥反應時檢測PD-1mRNA的表達能否其作為器官移植術后急性排斥反應預警；同時探討PD-1分子在器官移植患者外周血淋巴細胞上的表達與循環(huán)中CD4+CD25highTreg的相關性,從而進一步研究其誘導免疫耐受的機制。
　　 方法：應用實時定量RT-PCR技術和流式細胞學技術分別檢測PD-

3、1在健康對照者組和腎移植受者術前術后外周血上表達情況；應用RT-PCR技術檢測PD-1mRNA在腎移植術后急性排斥反應受者外周血的表達,免疫組化方法用來進一步鑒定PD-1的表達；應用單向混合淋巴細胞培養(yǎng)和流式細胞學檢測進一步探討PD-1通路和CD4+CD25highTreg細胞的相關性從而研究其誘導免疫耐受的機制；應用SPSS16統(tǒng)計軟件統(tǒng)計臨床及實驗數(shù)據(jù)。
　　 結果：實時定量RT-PCR檢測健康對照組、腎移植d0組、腎移植后

4、d28組PD-1mRNA相對表達量,使用Kruskal-Wallis法秩和檢驗法,健康對照組1.5±1.101,腎移植d0組4.221±1.106,腎移植后d28組9.633±2.101,三組間兩兩比較P<0.01,差異有統(tǒng)計學意義。PD-1的表達隨病程階段呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢,流式細胞學檢測PD-1+CD3+Tcell百分比呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。應用Kruskal-Wallis檢驗,三組外周血中PD-1mRNA的相對表達量發(fā)現(xiàn)急性

5、排斥反應受者外周血PD-1mRNA顯著高于腎功能穩(wěn)定者,P<0.01.三組中位數(shù)值分別為4.52±1.1,1.12±0.6,0.7±0.4。PD-1mRNA的相對表達量與急性排斥反應患者血清肌酐呈正比關系。使用Spearman's相關檢驗(r=0.81,P=0.03),在急性排斥反應患者組發(fā)現(xiàn)了PD-1mRNA和血清肌酐的顯著相關性Spearman's相關檢驗(r=0.81,P=0.03)。而移植腎功能延遲恢復受者(r=0.02,P=0

6、.73)、移植腎功能穩(wěn)定受者(r=0.06,P=0.58)不具有這種相關性。急性排斥反應發(fā)生時PD-1mRNA表達與急性排斥反應的嚴重性呈正相關。使用Spearman's相關檢驗,我們觀察到在急性排斥反應患者組PD-1mRNA的相對表達量和從腎移植手術到發(fā)生急性排斥反應時間的顯著相關性(r=0.71,P=0.04)。同時我們用免疫組化的方法證實了急性排斥反應時浸潤淋巴細胞表面大量PD-1的表達。三組均顯CD4+CD25+Treg表面PD

7、-1的表達比CD4+CD25-Treg表面PD-1的表達高,具有統(tǒng)計學差異；而三組之間比較發(fā)現(xiàn),急排組PD-1的表達水平和CD4+CD25highTreg最高,具有統(tǒng)計學差異。單向混合淋巴細胞培養(yǎng)后檢測到逐漸減少的CD4+CD25+Treg數(shù)量,分別為19.1％(處理組)、27.4％(對照組),而CD69在受抑制的CD4+CD25-細胞上的表達增加,分別為41.2％(處理組)、25.1％(對照組)。這些結果說明在急性排斥反應患者外周血P

8、BMC的體外實驗中,PD-1通路的抑制可能調節(jié)CD4+CD25+Treg細胞的功能,從而導致被CD4+CD25+Treg細胞抑制的T細胞的激活。
　　 結論：PD-1在健康人群中可有表達,腎移植術前組、腎移植術后組明顯高于健康對照組,具有顯著統(tǒng)計學差異,并且腎移植術后不同時間點PD-1mRNA呈先降低后升高的趨勢,PD-1+CD3+T細胞比例呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢；腎移植術后早期PD-1mRNA表達升高可以作為排斥反應的預警信號

9、指導臨床治療,同時患者PD-1表達與急性排斥反應嚴重程度呈正比,和發(fā)生急性排斥反應的時間呈反比,免疫組化結果再次證實了急性排斥反應時淋巴細胞表面大量的PD-1分子的表達；在急性排斥反應發(fā)生時外周血CD4+CD25highTreg數(shù)量增加,而使用抗PD-L1單克隆抗體抑制PD-1通路后CD4+CD25highTreg數(shù)量明顯降低,而CD69作為T細胞活化信號在CD4+CD25-T細胞表面增加,說明了PD-1通路參與了腎移植術后急性排斥反應