腎移植受者PD-1-PD-L1信號(hào)通路在基礎(chǔ)和臨床研究.pdf

1、背景：負(fù)性調(diào)控共刺激分子PD-1(programmed death-1)為T、B淋巴細(xì)胞表面受體,屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,生理?xiàng)l件下在淋巴細(xì)胞表面少量表達(dá),在T、B細(xì)胞抗原受體激發(fā)后呈誘導(dǎo)性表達(dá)。PD-1與其兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2結(jié)合,在免疫應(yīng)答中起著負(fù)性調(diào)控作用。關(guān)于PD-1/PD-L信號(hào)通路與臨床疾病的關(guān)系,如自身免疫性疾病、腫瘤、病毒感染、移植等,其表現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)作用受到越來越多的關(guān)注。
　　 目的：本

2、課題通過對(duì)比腎移植術(shù)前術(shù)后與健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面PD-1的表達(dá),了解PD-1與器官移植耐受的相關(guān)性；以及進(jìn)一步探討腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)檢測PD-1mRNA的表達(dá)能否其作為器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)預(yù)警；同時(shí)探討PD-1分子在器官移植患者外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)與循環(huán)中CD4+CD25highTreg的相關(guān)性,從而進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)和流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分別檢測PD-

3、1在健康對(duì)照者組和腎移植受者術(shù)前術(shù)后外周血上表達(dá)情況；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測PD-1mRNA在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)受者外周血的表達(dá),免疫組化方法用來進(jìn)一步鑒定PD-1的表達(dá)；應(yīng)用單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞學(xué)檢測進(jìn)一步探討PD-1通路和CD4+CD25highTreg細(xì)胞的相關(guān)性從而研究其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制；應(yīng)用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測健康對(duì)照組、腎移植d0組、腎移植后

4、d28組PD-1mRNA相對(duì)表達(dá)量,使用Kruskal-Wallis法秩和檢驗(yàn)法,健康對(duì)照組1.5±1.101,腎移植d0組4.221±1.106,腎移植后d28組9.633±2.101,三組間兩兩比較P<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD-1的表達(dá)隨病程階段呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢,流式細(xì)胞學(xué)檢測PD-1+CD3+Tcell百分比呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),三組外周血中PD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)急性

5、排斥反應(yīng)受者外周血PD-1mRNA顯著高于腎功能穩(wěn)定者,P<0.01.三組中位數(shù)值分別為4.52±1.1,1.12±0.6,0.7±0.4。PD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量與急性排斥反應(yīng)患者血清肌酐呈正比關(guān)系。使用Spearman's相關(guān)檢驗(yàn)(r=0.81,P=0.03),在急性排斥反應(yīng)患者組發(fā)現(xiàn)了PD-1mRNA和血清肌酐的顯著相關(guān)性Spearman's相關(guān)檢驗(yàn)(r=0.81,P=0.03)。而移植腎功能延遲恢復(fù)受者(r=0.02,P=0

6、.73)、移植腎功能穩(wěn)定受者(r=0.06,P=0.58)不具有這種相關(guān)性。急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)PD-1mRNA表達(dá)與急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。使用Spearman's相關(guān)檢驗(yàn),我們觀察到在急性排斥反應(yīng)患者組PD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量和從腎移植手術(shù)到發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)間的顯著相關(guān)性(r=0.71,P=0.04)。同時(shí)我們用免疫組化的方法證實(shí)了急性排斥反應(yīng)時(shí)浸潤淋巴細(xì)胞表面大量PD-1的表達(dá)。三組均顯CD4+CD25+Treg表面PD

7、-1的表達(dá)比CD4+CD25-Treg表面PD-1的表達(dá)高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而三組之間比較發(fā)現(xiàn),急排組PD-1的表達(dá)水平和CD4+CD25highTreg最高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后檢測到逐漸減少的CD4+CD25+Treg數(shù)量,分別為19.1％(處理組)、27.4％(對(duì)照組),而CD69在受抑制的CD4+CD25-細(xì)胞上的表達(dá)增加,分別為41.2％(處理組)、25.1％(對(duì)照組)。這些結(jié)果說明在急性排斥反應(yīng)患者外周血P

8、BMC的體外實(shí)驗(yàn)中,PD-1通路的抑制可能調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的功能,從而導(dǎo)致被CD4+CD25+Treg細(xì)胞抑制的T細(xì)胞的激活。
　　 結(jié)論：PD-1在健康人群中可有表達(dá),腎移植術(shù)前組、腎移植術(shù)后組明顯高于健康對(duì)照組,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且腎移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PD-1mRNA呈先降低后升高的趨勢,PD-1+CD3+T細(xì)胞比例呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢；腎移植術(shù)后早期PD-1mRNA表達(dá)升高可以作為排斥反應(yīng)的預(yù)警信號(hào)

9、指導(dǎo)臨床治療,同時(shí)患者PD-1表達(dá)與急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度呈正比,和發(fā)生急性排斥反應(yīng)的時(shí)間呈反比,免疫組化結(jié)果再次證實(shí)了急性排斥反應(yīng)時(shí)淋巴細(xì)胞表面大量的PD-1分子的表達(dá)；在急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)外周血CD4+CD25highTreg數(shù)量增加,而使用抗PD-L1單克隆抗體抑制PD-1通路后CD4+CD25highTreg數(shù)量明顯降低,而CD69作為T細(xì)胞活化信號(hào)在CD4+CD25-T細(xì)胞表面增加,說明了PD-1通路參與了腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)