hTGF-β1、hBMP-2基因修飾骨髓間充質干細胞生物學特性的實驗研究.pdf

1、目的：（1）在明確人轉化生長因子β（hTGF-β）誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）向骨組織細胞分化作用的基礎上，基于轉基因技術實現(xiàn)BMSCs的hTGF-β1基因修飾；（2）研究hTGF-β1聯(lián)合hBMP-2協(xié)同誘導BMSCs成骨作用的影響，闡明其成為理想骨組織工程種子細胞價值。
　　 方法：1.利用基因同源重組原理，通過AdMax腺病毒系統(tǒng)構建hTGF-β1重組腺病毒，以及對照組病毒pAdMax-EGFP-3FLAG。

2、　　 2.目的基因修飾的骨髓間充質干細胞的建立：（1）采用差速貼壁傳代篩選法和流式細胞鑒定相結合，分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞；（2）通過腺病毒載體介導hTGF-β1基因轉染BMSCs，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，確定最佳感染復數(shù)；（3）RT-PCR檢測轉染后BMSCs中hTGF-β1的表達情況；ELISA檢測轉染細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的表達。
　　 3.雙基因修飾的BMSCs細胞生物學特性分析：將外源基因修飾的BMS

3、Cs分為5組：A.正常MSCs組；B.空病毒修飾組；C.hBMP-2修飾組；D.hTGF-β1修飾組；E.hTGF-β1+hBMP-2修飾組。
　　 （1）采用MTT法測定各組細胞增殖能力；
　　 （2）酶促反應檢測細胞堿性磷酸酶活性。
　　 結果：(1)成功將hTGF-β1基因導入表達載體pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中，構建了重組腺病毒Ad-hTGF-β1,DNA測序證明，所克隆目的基因序列與Gene

4、bank收錄一致。
　　 （2）通過結合貼壁培養(yǎng)法和流式細胞鑒定高效、快速的分離純化大鼠骨髓間充質干細胞，并通過GFP熒光表達提示目的基因存在于所轉染的細胞中；RT-PCR顯示轉染細胞中有大量目的基因mRNA轉錄；ELISA結果顯示轉染細胞胞漿中有目的蛋白的表達。
　　 （3）不同基因修飾后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增強，其中hTGF-β1和 hBMP-2共同修飾對促進MSCs的增殖能力最明顯；ELISA檢測顯示