sTNFRⅡ-gAD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　1:從人臍帶組織分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UC-MSCs)，探討其分離方法、培養(yǎng)條件、細(xì)胞表型以及多向分化潛能等生物學(xué)特征。
　　2:構(gòu)建sTNFRⅡ-gAD基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，探討其原有的免疫調(diào)節(jié)性能和新獲得的抵抗高濃度TNFα的能力。
　　3:應(yīng)用sTNFRⅡ-gAD基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎，探討其在體內(nèi)

2、的發(fā)揮免疫調(diào)控作用的機(jī)制。
　　方法:
　　1:①建立分離培養(yǎng)方法:組織塊貼壁法分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。②細(xì)胞生長及增殖曲線的測定③流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫表型④誘導(dǎo)分化培養(yǎng)檢測其分化潛能。
　　2:通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將sTNFRⅡ-gAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細(xì)胞，G418篩選獲取穩(wěn)定表達(dá)sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的MSCs。不同濃度的IFNγ刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面分子ICAM-1和胞內(nèi)IDO的表達(dá)，來研究其原有免疫

3、調(diào)節(jié)性能。不同濃度的TNFα刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面分子ICAM-1表達(dá)，來研究其抵抗高濃度TNFα的能力。
　　3:牛Ⅱ型膠原+完全弗氏佐劑誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎。腹腔注射sTNFRⅡ-gAD基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對其進(jìn)行治療。觀察小鼠關(guān)節(jié)腫脹，測量記錄足掌厚度，進(jìn)行臨床評分。測量小鼠血清炎癥因子濃度。分離小鼠脾臟，流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg比例。
　　結(jié)果:
　　1:通過組織塊貼壁法分離培養(yǎng)得到纖維養(yǎng)貼壁生長細(xì)胞，傳代后，生

4、長至90％匯合度呈現(xiàn)典型漩渦狀;流式細(xì)胞術(shù)檢測其免疫表型顯示，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志(CD29，CD44，CD73，CD90，CD105)，表達(dá)MHC-Ⅰ類分子;不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志，CD34，CD45，不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子;誘導(dǎo)分化培養(yǎng)表明其具有成骨和成脂分化能力。
　　2:通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，G418篩選，成功得到穩(wěn)定表達(dá)sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的MSCs?；蛐揎棝]有影響MSCs的免疫表型和IFNγ刺激對其免疫調(diào)節(jié)分子ICAM

5、-1和IDO的上調(diào)作用?；蛐揎検归g充質(zhì)干細(xì)胞獲得了抵抗高濃度TNFα的新功能。
　　3:小鼠關(guān)節(jié)炎造模成功。腹腔注射sTNFRⅡ-gAD基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療減輕了其嚴(yán)重程度。降低了其炎癥因子水平。促進(jìn)了其脾臟Treg的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　1:成功分離和培養(yǎng)臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞
　　2:成功獲得既保持原有免疫調(diào)節(jié)性能，又能抵抗高濃度TNFα的間充質(zhì)干細(xì)胞
　　3:sTNFRⅡ-gAD基因修飾的間充