hTGF-b1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞再生軟骨組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、種子細(xì)胞來(lái)源問題已成為限制軟骨組織工程進(jìn)一步發(fā)展和臨床應(yīng)用的主要“瓶頸”問題。研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在特定培養(yǎng)條件下可定向誘導(dǎo)分化為軟骨，但將誘導(dǎo)的BMSCs與可降解生物材料復(fù)合植入動(dòng)物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)幾乎無(wú)軟骨組織形成，可能因?yàn)樵贐MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞過程中，誘導(dǎo)因子尤其是hTGF-b1起了非常關(guān)鍵的作用，而當(dāng)將經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs植入體內(nèi)后，由于失去體外特定培養(yǎng)液中的高濃度的hTGF-b1的誘導(dǎo)作用，大部分經(jīng)誘導(dǎo)的

2、BMSCs可能會(huì)“反分化”而不再分泌軟骨細(xì)胞特異性基質(zhì)，最終幾乎不能形成軟骨組織。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程方法將主要誘導(dǎo)因子基因TGF-b1轉(zhuǎn)入BMSCs，使外源基因在一定時(shí)期內(nèi)能高效表達(dá)，植入體內(nèi)后能通過自分泌或旁分泌途徑來(lái)表達(dá)目的誘導(dǎo)因子，進(jìn)一步促進(jìn)其分化和維持表型穩(wěn)定，從而彌補(bǔ)由于突然失去體外特定培養(yǎng)液中的高濃度hTGF-b1的誘導(dǎo)作用而可能發(fā)生的“反分化”。本實(shí)驗(yàn)旨在探討如下四部分問題： 1．?dāng)y帶人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的腺病毒載體

3、的構(gòu)建及鑒定 方法:應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建重組hTGF-b1腺病毒表達(dá)載體，分別用限制性內(nèi)切酶和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定,并通過脂質(zhì)體Fugene6介導(dǎo)腺病毒DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。 結(jié)果:重組hTGF-b1腺病毒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI酶切后，得到14.5Kb、8.1 Kb、4.2 Kb、4.0 Kb、2.5 Kb、1.4 Kb、0.6 Kb片段，經(jīng)PI-SceI/I-CeuI雙酶切后，得到32.6 Kb片段和2.6

4、 Kb含目的基因的片段，片段大小無(wú)誤，表明重組hTGF-b1腺病毒(adeno-hTGF-b1)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。以重組adeno-hTGF-b1 DNA為模板的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)1.35kb hTGF-b1目的基因片段，表明hTGF-b1基因成功連接至adeno-X腺病毒表達(dá)載體中。重組hTGF-b1 腺病毒表達(dá)載體通過Fugene 6 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293 包裝細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。采用PCR反應(yīng)鑒定293細(xì)胞包裝的腺病毒，擴(kuò)增

5、出247bp的 hTGF-b1目的基因片斷和312 bp腺病毒骨架基因片斷。 2．重組hTGF-b1腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能表達(dá)的鑒定 方法:重組hTGF-b1腺病毒轉(zhuǎn)染第一代豬BMSCs，轉(zhuǎn)染后以RT-PCR檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后hTGF-b1 mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)定性和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)定量檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染hTGF-b1蛋白的表達(dá)，水貂肺上皮細(xì)胞(Mu1lV )生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)的hTGF-b1

6、生物學(xué)活性。 結(jié)果:adeno-hTGF-b1轉(zhuǎn)染BMSCs有hTGF-b1 mRNA的有效表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后BMSCs胞漿內(nèi)有大量棕黃色的hTGF-b1蛋白表達(dá)，ELISA結(jié)果提示adeno-hTGF-b1轉(zhuǎn)染的BMSCs,其hTGF-β1表達(dá)量是轉(zhuǎn)染adeno-lacZ 的BMSCs 2.65倍，差異有顯著性,Mu1Lv細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定證實(shí)BMSCs分泌hTGF-b1蛋白有生物學(xué)活性。 3. 重

7、組hTGF-b1腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs對(duì)其向軟骨分化的影響 方法:重組adeno-hTGF-b1轉(zhuǎn)染第一代豬BMSCs，對(duì)照組轉(zhuǎn)染adeno-LacZ，腺病毒的量以200pfu/細(xì)胞計(jì)算，轉(zhuǎn)染后1天，消化收集重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs，置于無(wú)菌15ml聚丙烯試管中，體外細(xì)胞團(tuán)聚集連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，然后分別從大體觀察、組織學(xué)和II型膠原蛋白免疫組化的檢測(cè)對(duì)形成組織進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組HE染色觀察可見細(xì)胞團(tuán)外周為由數(shù)層

8、扁平狀成纖維樣細(xì)胞組成的纖維軟骨膜，下層和中部區(qū)域有巢狀軟骨形成，軟骨陷窩明顯可見，軟骨細(xì)胞較均勻分布，包埋在軟骨陷窩內(nèi)。Safranin’O染色顯示，形成的軟骨組織區(qū)域有大量被染成桔紅色蛋白多糖類基質(zhì)分泌，Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測(cè)顯示細(xì)胞團(tuán)中央出現(xiàn)較明顯的陽(yáng)性染色區(qū)域，可見棕黃色的顆粒分布于胞漿內(nèi)。對(duì)照組HE染色觀察見無(wú)軟骨樣組織形成，主要為較致密無(wú)結(jié)構(gòu)特征的纖維樣組織，Safranin’O染色也未見被染成桔紅色蛋白多糖類基質(zhì)分泌，Ⅱ

9、型膠原免疫組化染色檢測(cè)顯示無(wú)明顯的陽(yáng)性染色區(qū)。 4．重組hTGF-b1腺病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs在裸鼠體內(nèi)成軟骨能力初步研究 方法:重組adeno-hTGF-b1轉(zhuǎn)染第一代豬BMSCs，對(duì)照組轉(zhuǎn)染adeno-LacZ，腺病毒的量以200pfu/細(xì)胞計(jì)算，轉(zhuǎn)染后1天，消化收集重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs，以濃度為5×107/ml細(xì)胞懸液均勻接種于圓盤狀PGA支架上，體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10d, 然后植入裸鼠背部皮下,在植入后第4周

10、取材，分別行大體觀察、組織學(xué)和II型膠原免疫組化檢測(cè)對(duì)形成組織進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組 HE染色觀察到形成的軟骨區(qū)域有較清楚的軟骨陷窩，軟骨細(xì)胞分布較均勻，包埋在軟骨陷窩內(nèi)，部分區(qū)域可見較多的纖維組織和少量的骨組織，對(duì)照組HE染色觀察到有些區(qū)域也有軟骨形成，但可見較多的纖維組織和少量的骨組織，應(yīng)用圖象分析軟件定量分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組形成軟骨占總組織百分比，分別為41.83±4.64（％）和17.50±2.85（％），差異有顯著性。

11、Safranin’O染色顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組形成的軟骨組織區(qū)域都有被染成桔紅色蛋白多糖類基質(zhì)分泌，Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測(cè)形成的軟骨組織區(qū)域也有較明顯的陽(yáng)性染色區(qū)域，可見棕黃色的顆粒分布于胞漿內(nèi)。 結(jié)論： 1．已成功構(gòu)建攜帶人 hTGF-b1重組腺病毒載體，并能在293細(xì)胞包裝和擴(kuò)增。 2．重組hTGF-b1腺病毒能夠被導(dǎo)入BMSCs，并表達(dá)有生物學(xué)活性hTGF-b1蛋白。 3．應(yīng)用重組hTGF-b1腺病