BMP-7基因修飾骨髓間充質干細胞治療IgA腎病的實驗研究.pdf

1、背景和目的： IgA腎病(IgAnephropathy，IgAN)是以反復發(fā)作性肉眼或鏡下血尿，腎小球系膜細胞增生，基質增多，球囊基底膜變形、裂解伴廣泛IgA沉積為特點的原發(fā)性腎小球疾病，是我國慢性腎小球腎炎中最常見的一種類型，約25％的患者在確診IgAN后5年～25年內發(fā)展為終末期腎臟疾病(endstagerenaldisease，ESRD)。迄今為止，本病尚無滿意的治療方案，治療仍定位在糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、雷公藤多甙、AC

2、EI等非特異性治療上，因此研究新的抑制IgA沉積，促進腎小球功能恢復的治療方法是迫切需要解決的問題。近幾年研究結果提示骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)移植可能是一種很有潛力的治療腎病疾病的方法。BMSCs是存在于骨髓中的一類成體干細胞，具有易獲得、易培養(yǎng)、可以跨胚層分化、能在宿主體內長期存活、易于攜帶外源基因和長期表達等優(yōu)點。目前研究發(fā)現BMSCs具有向腎臟實質細胞分化的潛能，

3、可以參與腎臟損傷后的再生和修復，具有保護腎臟，改善腎功能的作用。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是TGF-β超家族成員之一，不僅能促進胚胎后腎間質細胞向上皮細胞轉分化，而且還可誘導系膜細胞、上皮細胞、內皮細胞的分化和發(fā)育，拮抗TGF-β對系膜細胞的刺激作用，減少系膜基質的增多，具有抗炎、抗纖維化等特點，在維持正常腎臟功能，抑制腎小球和腎間質纖維化中具有重要作用。 因

4、此，本研究以骨髓間充質干細胞移植能否應用于IgA腎病的治療以及BMP-7基因修飾的BMSCs移植是否更有治療潛力為研究目的，建立IgA腎病模型，選擇BMP-7作為治療基因，GFP作為報告基因，將攜帶GFP或BMP-7基因的BMSCs移植入IgAN鼠體內，觀察BMSCs在腎臟的分布、分化及改善腎功能的情況，觀察和評價BMP-7基因修飾的BMSCs移植是否更有利于腎功能恢復，為探討IgA腎病新的治療手段提供實驗基礎。 方法：

5、 1.用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結合的方法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀和免疫細胞化學方法對細胞表型進行鑒定，同時對培養(yǎng)細胞進行成骨、成脂誘導分化，采用堿性磷酸酶、茜素紅及油紅O染色觀察BMSCs誘導分化情況。 2.采用分子克隆技術，構建重組質粒pAAV-BMP-7。采用磷酸鈣沉淀法，重組質?；騪AAV-GFP與pAAV-RC、pHelper共轉染HEK-293細胞，產生具有傳染性的病毒顆粒。將

6、此病毒顆粒轉染骨髓間充質干細胞，用免疫細胞化學方法及熒光顯微鏡觀察BMSCs表達BMP-7及GFP的情況。 3.建立小鼠IgA腎病模型，隨機分為模型組，GFP移植組及BMP-7移植組。將轉染GFP或BMP-7基因的骨髓間充質干細胞通過尾靜脈移植入IgA腎病鼠體內，分別于移植后第7d、21d、56d處死小鼠，采用免疫組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察BMSCs在腎臟的分布情況，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP陽性的BMSCs表達desm

7、in及CD31情況；采用Westemblot方法觀察BMP-7基因修飾的BMSCs移植后腎臟是否有更多的BMP-7蛋白表達；通過血液、尿液生化及病理切片分析BMSCs移植后腎臟恢復情況，以及攜帶BMP-7基因的BMSCs移植是否比單純BMSCs移植更有利于IgA腎病腎功能的恢復。 結果： 1.小鼠原代骨髓間充質干細胞呈集落樣生長，細胞形態(tài)呈梭形，傳代后細胞生長迅速，形態(tài)比較均一，大部分細胞為成纖維樣或多角形；流式細胞儀檢

8、測結果顯示，細胞強表達CD29、CD44、CD90、CD166，不表達CD34、CD45；免疫細胞化學染色結果顯示BMSCs明顯表達vimentin(間充質細胞標志蛋白)，不表達E-cadherin(上皮細胞標志蛋白)；BMSCs在特定誘導條件下可以向成骨細胞、脂肪細胞分化，在加入成骨誘導培養(yǎng)基第14d，細胞堿性磷酸酶染色陽性，隨著時間的延長，可見圓形或卵圓形礦化結節(jié)，茜素紅染色呈紅色；加入成脂肪誘導培養(yǎng)基2w后，細胞內可見多個折光性強

9、的圓形脂肪滴，油紅O染色呈紅色。 2.重組腺相關病毒rAAV-GFP和rAAV-BMP-7被成功包裝和產生，經純化后滴度達到3-4×1010IU/ml以上；轉染BMSCs后，經熒光顯微鏡及免疫組化觀察證實了GFP或BMP-7在BMSCs中的表達，轉染率在70％左右。 3.使用飲食BSA和注射細菌毒素SEB復合造模的方法，建立了小鼠IgA腎病模型，表現為出現蛋白尿，免疫熒光顯示腎小球系膜區(qū)有線狀或團塊狀IgA免疫復合物沉積

10、，腎臟病理可見腎小球腫脹，體積增大，系膜彌漫性增生。 4.將攜帶GFP基因的BMSCs移植入IgA腎病鼠體內后7d，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示腎小球及其周圍可見少量GFP陽性細胞，移植后56d，腎小球內GFP陽性細胞明顯增多，并且在小球周圍、腎間質及包膜下均可見呈現綠色熒光的細胞；免疫細胞化學顯示部分GFP陽性細胞同時表達desmin或CD31；攜帶BMP-7基因的BMSCs移植入IgA腎病鼠體內后，免疫組化結果顯示腎小球內可見少

11、量BMP-7陽性細胞，Westernblot結果顯示隨著移植時間的延長，腎臟表達BMP-7蛋白量明顯增多，并且同時相點，BMP-7移植組BMP-7蛋白量較GFP移植組高：腎臟病理切片免疫熒光顯示移植BMSCs后，沉積在腎小球系膜區(qū)的IgA明顯減少：血液及尿液生化分析表明移植BMSCs后，小鼠血清肌酐、尿素氮及24h尿蛋白量明顯降低，移植后56d，BMP-7移植組小鼠肌酐、尿素氮及24h尿蛋白量較GFP移植組下降明顯。 結論：

12、 1.利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結合的方法，可以獲得較高純度的骨髓間充質干細胞，這些細胞具有典型的間充質細胞形態(tài)及細胞表型，在特定誘導條件下可以向脂肪細胞及成骨細胞分化。 2.成功構建重組腺相關病毒rAAV-BMP-7和rAAV-GFP，經純化后病毒滴度達到3-4×1010IU/ml，該病毒可以高效轉染骨髓間充質干細胞，所攜帶的目的基因可以在BMSCs中長期穩(wěn)定表達。 3.經靜脈途徑植入的小鼠骨髓間充質干細胞能夠在