博爾納病病毒核蛋白多克隆抗體和單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、研究目的
　　博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種具有高度嗜神經(jīng)性的病毒，宿主范圍很廣，可引起多種溫血?jiǎng)游锏淖匀桓腥?，表現(xiàn)出以明顯的精神、行為異常等為特征的神經(jīng)精神癥狀。這與人類神經(jīng)精神疾病患者的臨床表現(xiàn)相類似，人們開始研究該病毒感染與人類神經(jīng)精神疾病之間的關(guān)系。需要建立高效靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)BDV進(jìn)行更加全面的研究。血清免疫學(xué)檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快捷、特異等優(yōu)點(diǎn)可以作為BDV流行病學(xué)檢測(cè)和臨床診斷的

2、一項(xiàng)重要手段，從而可以結(jié)合核酸檢測(cè)來(lái)增大診斷的準(zhǔn)確率。BDV基因組編碼6種蛋白。其中核蛋白和磷蛋白分別在感染細(xì)胞的胞核和胞漿中表達(dá)水平較高，可作為檢測(cè)的主要目標(biāo)抗原。
　　本實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)物免疫技術(shù)、細(xì)胞雜交-雜交瘤技術(shù)制備抗BDV核蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，并鑒定其生物學(xué)、免疫學(xué)和理化特性。為研究BDV感染的發(fā)病機(jī)制以及研制相關(guān)診斷檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　1.將本實(shí)驗(yàn)室早期構(gòu)建的重組載體pET14b

3、-p40轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，His-tag親和層析純化獲得BDV重組核蛋白。
　　2.將重組核蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，收集免疫后血清，制備和純化多克隆抗體，ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，并進(jìn)行Western-Blot鑒定。
　　3.利用重組核蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)融合，用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤，挑選效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀

4、釋法克隆和亞克隆，建立穩(wěn)定分泌抗BDV核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并制備、純化單克隆抗體，對(duì)其進(jìn)行特異性、效價(jià)等鑒定。
　　結(jié)果
　　1.成功表達(dá)并純化了BDV核蛋白。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，該蛋白分子量約為40KD。
　　2.BDV核蛋白多克隆抗體純化后經(jīng)ELISA檢測(cè)效價(jià)高達(dá)1：256000，該抗體與原核和真核系統(tǒng)中表達(dá)的核蛋白均能發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.建立了一株能穩(wěn)定分泌抗BDV核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

5、，命名為2F6E8，此雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性好，連續(xù)傳代20次、反復(fù)凍存復(fù)蘇4次、仍能分泌單克隆抗體。該抗體重鏈為IgG2a，輕鏈為κ。ELISA法測(cè)得細(xì)胞上清的效價(jià)達(dá)1:1600以上，腹水的效價(jià)達(dá)1:32000以上。WB實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明該單克隆抗體能特異性結(jié)合重組BDV核蛋白及天然BDV核蛋白。
　　結(jié)論
　　本研究成功制備了抗BDV核蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，可以為BDV的基礎(chǔ)研究提供有力的工具，為研究針對(duì)B