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文檔簡介
1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)廣泛存在于生物體細胞中,參與體內轉甲基、轉硫基和聚胺合成等多種重要的反應,它在肝病、抑郁癥和關節(jié)炎等疾病的治療與預防中有重要的應用,市場需求量巨大。本文運用代謝工程技術對釀酒酵母工業(yè)菌株ZJU001中SAM合成的相關代謝途徑進行改造以提高SAM的產量。
在菌株ZJU001中利用多拷貝整合型質粒pYMIKP-SAM2實現了SAM2基因的過表達,增加了胞內SAM合成酶的表達量,提高菌株合成SAM的能力。在1
2、0L發(fā)酵罐上,改造菌株的SAM產量達到8.81g/L,比原始菌株提高了27.1%。
以模式菌株BY4741為對象開展了釀酒酵母胞內合成SAM相關代謝網絡的研究。從SAM合成的底物供給、SAM合成后的累積及降解途徑等角度出發(fā),分別構建了P型ATP酶基因PMR1、糖原支鏈酶基因GLC3、細胞周期蛋白依賴性激酶基因PHO85和SAM脫羧酶基因SPE2等四個基因敲除的突變菌株??疾旄魍蛔兙闟AM的合成能力,發(fā)現GLC3和SPE2的單
3、獨缺失有利于釀酒酵母對SAM的合成與積累。
為提高工業(yè)菌株ZJU001中基因敲除的穩(wěn)定性,建立了一套針對雙倍體工業(yè)菌株的基因快速敲除的新方法。構建了ZJU001中的GLC3、SPE2、ERG4和ERG6四個基因分別敲除及GAL11基因過表達的五個突變菌株。通過考察突變菌株的SAM合成能力,結果顯示GLC3和SPE2基因敲除的突變菌株其SAM產量分別提高了20.1%和12.4%。
運用標記回收的基因敲除技術在ZJU00
4、1中同時敲除GLC3和SPE2,并過表達SAM2,獲得工程菌ZJU001-GS-SAM2。該菌在搖瓶發(fā)酵中的SAM產量達到1.14g/L,是出發(fā)菌株的1.7倍,結果表明三個基因改造對促進SAM的合成和積累具有協(xié)同作用。
運用反饋控制分批補料發(fā)酵策略在10L罐上考察了ZJU001-glc3、ZJU001-spe2、ZJU001-GS以及ZJU001-GS-SAM2的SAM生產能力,結果顯示ZJU001-GS-SAM2的SAM產量
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