基于輔因子調控的s-腺苷蛋氨酸合成研究.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一種在生物中廣泛存在并具有重要生理功能的小分子物質。臨床上將SAM用于關節(jié)炎、肝病、抑郁癥等疾病的治療，效果顯著。目前SAM主要通過微生物發(fā)酵制備，但存在產(chǎn)量低，前體L-蛋氨酸和ATP供應不足等問題。
　　研究者試圖通過代謝工程改造以提高菌株生產(chǎn)SAM的能力，然而SAM在微生物中的代謝途徑冗長復雜，而且不是終端代謝產(chǎn)物，僅針對主代謝途徑中涉及到的基因進行分子操作，并不能大幅度提高SAM產(chǎn)量。作為胞內重要微

2、環(huán)境的輔因子ATP/ADP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+參與了細胞內大量的反應過程，將物質代謝途徑聯(lián)成復雜的網(wǎng)絡體系，最終導致物質代謝流的分配受到輔因子形式和濃度的牽制。因此，通過輔因子工程手段調控胞內代謝物的合成具有極大的潛力。
　　本論文以解析輔因子對于SAM合成的調控機理為目的，通過代謝工程策略改造大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞內輔因

3、子形式和濃度，綜合運用熒光定量PCR和LC/MS/MS方法分析并總結輔因子對于產(chǎn)物合成的生理機制以及能量代謝和其他物質代謝的規(guī)律，為高產(chǎn)SAM的菌株的代謝工程改造提供理論基礎。主要研究工作如下:
　　1.建立基于合成的sRNA技術用于E.coli體系胞內輔因子調控的系統(tǒng)，通過干擾基因轉錄水平調控胞內輔因子水平。構建靶向紅色熒光蛋白的sRNA結合流式細胞儀和熒光定量PCR，證實了該策略可有效調控胞內基因轉錄表達，弱化效率可達85％。

4、應用該策略調控副產(chǎn)物競爭消耗ATP和NADPH的代謝途徑相關基因，構建了相應的合成sRNA: anti-proB,anti-glnA,anti-argB,anti-aroE,anti-argC,anti-proA，anti-ilvC和anti-proC。通過熒光定量PCR結果表明目標基因的轉錄水平都有不同程度的降低。與對照菌相比，帶有合成sRNA的重組菌胞內ATP水平和NADPH水平均有所提高，胞內SAM產(chǎn)量提高約1倍。
　　2.

5、在E.coli中通過分別引入NADH激酶(pos5p)以及轉氫酶(PntAB)和NAD激酶(YfjB)聯(lián)用構建兩種NADPH再生系統(tǒng)。分析NADPH濃度、NADPH/NADP+比率變化對于胞內物質代謝的擾動及產(chǎn)物SAM合成的關系，發(fā)現(xiàn)通過NADPH再生系統(tǒng)提高NADPH水平及NADPH/NADP+比率可以有效地促進胞內SAM的合成。其中基于NADH激酶再生系統(tǒng)使得胞內SAM產(chǎn)量提高13倍，產(chǎn)量達5.30mg/L。
　　3.由于S.

6、cerevisiae中的NADPH在線粒體和細胞質中的代謝相對獨立，因此在E.coli的研究基礎上，以S.cerevisiae BY4741單倍體模式菌株為研究對象，研究了不同亞細胞結構內NADPH對于產(chǎn)物合成的影響。通過激光共聚焦顯微鏡證實了成功在S.cerevisiae線粒體中表達了NADH激酶(pos5編碼)，在細胞質中表達了不帶信號肽的NADH激酶(pos5△17編碼)。實驗發(fā)現(xiàn)細胞質中NADPH再生的菌株NBYSM-1合成SA

7、M的能力以及NADH/NAD+比率、ATP水平均要明顯高于線粒體中NADPH再生的菌株NBYSM-2，NADPH/NADP+比率低于NBYSM-2。說明NADPH對于菌株合成SAM產(chǎn)量有促進作用，ATP對SAM的合成影響更為重要。
　　4.以S.cerevisiae為研究宿主，在過表達sam2的基礎上，構建了多種不同形式的ATP調控系統(tǒng)，pRS425-PHXT7-noxE-THXT7，pRS425-PHXT7-vhb-THXT7,

8、pRS425-PHXT7-ptxD-THXT7和pRS425-PHXT7-fdh1-THXT7。結果表明S-腺苷蛋氨酸合成酶活性對于SAM的合成影響極為重要，過表達sam2的菌株胞內SAM產(chǎn)量提高一倍。vhb和ptxD對于胞內SAM的合成有較為顯著的促進作用，其中菌株ABYSM-2發(fā)酵28 h胞內SAM濃度最高，與對照相比提高67％，可達54.92 mg/L。借助液質結合代謝組分析，發(fā)現(xiàn)重組菌株和對照菌株的代謝物差異較大，其中氨基酸途徑