利用大腸桿菌C4途徑合成5-氨基乙酰丙酸.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(ALA)作為所有吡咯化合物（例如血紅素、維生素B12、葉綠素）的前體物質，在農業(yè)和醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。農業(yè)上，ALA促進光合作用和組織分化，能夠選擇性殺死雙子葉植物的雜草而對農作物無害，增強植物的抗寒性和耐鹽性;醫(yī)學上，作為光動力學藥物，在診斷和治療癌癥方面效果顯著，在霉菌病和風濕性關節(jié)炎等疾病治療中的作用逐步被認可，對美容和護膚也有一定功效，具有很好的實際應用價值和工業(yè)前景。
　　傳統(tǒng)的ALA化學合成法

2、成本高、收率低、價格昂貴且造成嚴重的環(huán)境污染問題。生物合成法合成ALA具有生產過程簡單、生產潛力大且對環(huán)境友好等特點。ALA的生物合成主要有兩條途徑:一條C5途徑，由本實驗室首次構建，以葡萄糖為唯一碳源在大腸桿菌中發(fā)酵生產ALA，但該途徑涉及的酶較多，代謝調控復雜，且產量提高有難度;另一條是C4途徑，以琥珀酰-CoA和甘氨酸為前體，由于其途徑較短，調控簡單而被廣泛研究。然而昂貴的前體物質琥珀酰-CoA和甘氨酸的添加、好氧發(fā)酵過程對通氣量

3、和攪拌的較高要求使得生產成本較高。如何對C4途徑進行優(yōu)化，從而提高ALA產量和產率，降低生產成本成為本論文研究的重點。
　　本論文首先在好氧條件下對C4途徑進行了優(yōu)化，包括選取不同遺傳背景的大腸桿菌進行好氧發(fā)酵，比較其ALA生產能力及菌株代謝的不同;在提高溶氧條件下對不同遺傳背景菌株的ALA生產能力進行比較;進一步對不同來源ALA合酶的篩選優(yōu)化。結果表明不同遺傳背景的大腸桿菌菌株生產ALA的能力差別較大，生長情況也有很大不同;在能

4、同時分解脂肪酸和葡萄糖的KNSP菌株中表達來源于紅假單胞菌KUGB306的ALA合酶時，搖瓶發(fā)酵ALA產量達到3.61g/l，且該菌株生長較好，活力旺盛。本部分研究首次清晰地證實了利用重組大腸桿菌生產ALA的能力依賴于所選用的菌株背景，不同基因型的大腸桿菌由于代謝通量不同，ALA合酶的活力不同，ALA向下游轉化的趨勢也不盡相同，從而導致ALA產量有較大差別。
　　本論文進一步在大腸桿菌中建立了微好氧和好氧-厭氧雙階段發(fā)酵生產ALA

5、的策略。利用本實驗室已有的好氧-微好氧-厭氧琥珀酸高產菌YL106，該菌株能夠積累大量琥珀酸，且副產物如乳酸、乙酸等很少，進而為ALA的生產提供豐富的前體，通過表達來源于類球紅桿菌的ALA合酶得到YL106A菌株，該菌株微好氧搖瓶條件下能夠積累5.88 g/l ALA，產率為0.557 g ALA/g glucose，將該菌株進行5L罐發(fā)酵優(yōu)化，ALA產量達到7.67 g/l;為驗證由琥珀酸向琥珀酰-CoA轉化是否限速，嘗試在該菌中過表

6、達cat1或sucCD，發(fā)現(xiàn)cat1的過表達能夠明顯提高微好氧下ALA產率和生產速率，利用該菌進行低溶氧發(fā)酵有望降低通氣和攪拌的生產成本，簡化下游分離提取工藝。
　　本論文最后一部分嘗試以葡萄糖為唯一碳源合成前體琥珀酸和甘氨酸，最終實現(xiàn)由葡萄糖直接合成ALA，以降低C4途徑生產成本。本實驗室前期構建的絲氨酸產生菌能夠積累一定量的絲氨酸（4.5g/l），且流向甘氨酸的通量較大，而甘氨酸是ALA合成的兩種前體之一。進一步在絲氨酸產生菌

7、3Sp中敲除sucD，使得另一種前體琥珀酸不需外源添加。然后通過過表達ALA合酶，實現(xiàn)ALA的積累。同時我們還探究了不同來源的ALA合酶對ALA積累能力的影響，并且優(yōu)化了絲氨酸合成途徑相關的輔因子，如葉酸、磷酸吡哆醛、谷氨酸，最終得到一株大腸桿菌工程菌5SRPO，該菌株無需添加任何前體，以葡萄糖為唯一碳源時，搖瓶下能夠積累約0.21g/l的ALA。該部分首次建立了以葡萄糖為唯一碳源的ALA發(fā)酵策略，擺脫了現(xiàn)有技術中對琥珀酸和甘氨酸前體的