利用多重PCR和熒光定量PCR對羊肉進行定性定量鑒定方法的建立.pdf

1、分類號：密級：S8131單位代碼：學號：100862012328利用多重PCR和熒光定量PCR對羊肉進行定性定量鑒定方法的建立AnapproachfortheidentificationandquantificationofgoatandsheepmeatusingmultiplexPCRandRealtimePCR學位申請人：王思偉指導教師：張英杰教授學科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖學位類別：農學碩士授予單位：河北農業(yè)大學答辯日期：二。一

2、五年五月三十日摘要為了對羊肉進行定性鑒別，本試驗建立了一個多重PCR方法，可以一次性對山羊、綿羊、水貂、海貍鼠和鴨肉進行鑒別。利用線粒體基因設計五對引物，使山羊、綿羊、水貂、海貍鼠和鴨的擴增目的片段長度分別為577bp、265bp、23lbp、812bp和35lbp。通過特異性檢測，發(fā)現各物種引物僅能擴增出相應物種，其余物種均無擴增結果；且引物和引物之間、模板和模板之間均無干擾現象。通過引物濃度優(yōu)化試驗，可確定各物種引物的比例為山羊：綿

3、羊：水貂：海貍鼠：鴨=3：5：4：2：3。通過退火溫度優(yōu)化試驗，確定了多重PCR的最佳退火溫度為59℃。為了對羊肉進行定量鑒別，本試驗利用熒光定量Taqman探針法PCR，在線粒體Cytb基因上對山羊和綿羊設計特異性引物和探針，并同時在16SrRNA基因上設計內參引物和探針，對山羊和綿羊在混合肉樣中的含量進行測定。本試驗用DNA含量建立標準曲線，并對各物種質量與所提DNA含量的關系(D值)進行測量。通過對己知混合肉樣的測量，可知山羊肉含

4、量的平均相對誤差為682％，綿羊肉含量的平均相對誤差為814％。分別對多重PCR方法和熒光定量PCR方法進行靈敏性檢測。試驗證明，多重PCR反應的DNA模板最低檢測限是O1ng，而熒光定量PCR方法的最低檢測限為001ng。兩種方法均能用于檢測經高溫煮沸和高壓處理的肉樣。對多重PCR方法的待檢肉樣摻入不同比例的玉米粉，檢測結果無明顯影響。對含羊肉的混合肉樣進行定性定量鑒定的方法步驟為：(1)提取模板DNA；(2)用多重PCR方法確定物種